الجمعية في المختبر من نصف اصطناعية آلة الجزيئية واستخدامها للكشف عن الحمض النووي من التلف

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية تجميع واستخدام مستشعر مزدوج الوسم لتلف DNA يقوم بوضع وسم لنوعين رئيسيين من كسور DNA في المقاطع النسيجية. يتكون المستشعر من قليلة نوكليوتيد DNA من نوع 30 tumor مُوسمة مزدوجاً بـ ZI و Rumine، وإنزيم vaccinia topo isomerase one أو vac topo الذي يتجمع ذاتياً. عندما يرتبط VAC topo بـ 30 tumor، تبدأ العملية التشغيلية حيث يقوم topo بشطر قليلة النوكليوتيد عند الطرف الثلاثي (three prime) لتسلسل التعرف، مما ينتج عنه وحدة fitzy مُنشطة لـ vac topo ومشبك شعر حر مُوسم بـ amine.

بوجود مجموعة هيدروكسيل طرفية عند الموقع '3، تكون الوحدات قصيرة العمر وتُعاد صياغتها بسرعة في البنية الأصلية، التي يتم شطرها لاحقاً. وفي غياب كسور إضافية في الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين خارج الجزيئية، ينفصل هذان الوحدتان ويرتبطان بشكل مستمر وبطريقة دورية. وعند تطبيق المستشعر الجزيئي على مقاطع نسيجية تعاني من تلف في DNA، ترتبط وحدة الكشف الموُسمة بـ Fitz بشكل انتقائي بكسور DNA ذات النهايات غير الحادة التي تحتوي على مجموعة هيدروكسيل عند الموقع '5.

ستقوم وحدة الكاشف الموصومة بـ R domine بالارتباط بكسر ذو نهايات غير حادة يحتوي على فوسفات في الطرف خمسة-بريم. وفي حالة وجود T four DNA Ligase، يتم الحصول على نتائج توضح وجود وتوزيع كسور DNA من النوع الأول والنوع الثاني في الخلايا استناداً إلى المجهر الفلوري. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية للكشف عن HESIs مثل tunnel في كونها أكثر نوعية وتوفر معلومات إضافية من خلال وسم كل من مراحل الموت الخلوي المبرمج الذاتية والبلعمية.

من منظور تكنولوجيا النانو، يجسد هذا المستشعر نهجاً مدعوماً حيوياً يكيف البنى والهياكل البيولوجية الفعلية لإنشاء أجهزة على المقياس الجزيئي غير سامة. وبوجه عام، قد يواجه الأشخاص المبتدؤون في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن نجاحها يعتمد على استخدام تحضير عالي النشاط من Toro SOM والمعالجة الصحيحة للمقاطع لتجنب الهضم المفرط بواسطة proteinase K. يجب تحضير مقاطع الأنسجة لهذا الإجراء قبل تجميع الجهاز الجزيئي. يتم قطع مقاطع بسماكة تتراوح بين خمس إلى ست ميكرونات من paraldehyde.

يُوصى باستخدام كتل الأنسجة المثبتة في البارافين. ضع الشريحة التي تحتوي على مقطع النسيج في حامل شرائح، ثم قم بإزالة الشمع باستخدام xylene لمدة 15 دقيقة. بعد مرور 15 دقيقة، انقل الشريحة إلى حمام xylene جديد لمدة خمس دقائق إضافية.

أعد ترطيب المقطع بتمرير الشريحة عبر تركيزات الإيثانول المتدرجة التالية: 96% ethanol مرتين لمدة خمس دقائق في كل مرة، ثم 80% ethanol لمدة خمس دقائق، متبوعة بالماء.

مرتين لمدة خمس دقائق لكل مرة. بعد إعادة الترطيب، يتم هضم المقطع باستخدام proteinase K. وباستخدام 100 µL من محلول بتركيز 50 µg/mL لكل مقطع، يتم التحضين لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة داخل غرفة رطبة. قد يلزم تعديل وقت الهضم بناءً على نوع النسيج، ولكن يجب توخي الحذر لتجنب الهضم المفرط لأنه يتسبب في اختفاء الإشارة وتلف المقطع عند اكتمال عملية الهضم.

اشطف الشريحة بالماء المقطر مرتين لمدة 10 دقائق في كل مرة. ضع 2% BSA للإغلاق المسبق (pre blocking) واحضن الشريحة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة داخل غرفة رطبة. وخلال هذا الوقت، قم بتجميع الآلة الجزيئية كما هو موضح تالياً في هذا الفيديو.

تم قياس جميع الكواشف اللازمة لتجميع الآلة الجزيئية لتكفي حجماً إجمالياً قدره 25 microliters، وهي كمية كافية لعملية كشف واحدة في مقطع نسيجي متوسط الحجم. يمكن زيادة الحجم حسب الحاجة في أنبوب بلاستيكي صغير. اخلط الكواشف التالية بهذا الترتيب باستخدام الماء المقطر.

يتم خلط 15% polyethylene glycol 8,000 T four DNA Ligase buffer، و oligonucleotide مزدوج الوسم، و vaccinia topoisomerase one، و T four DNA Ligase برفق عن طريق الماصة. سيتجمع البناء الجزيئي ذاتياً بشكل فوري تقريباً في هذا المحلول ويمكن استخدامه مباشرة في درجة حرارة الغرفة. لبدء إجراء وسم كسور DNA، يتم سحب محلول ما قبل الحجب من الشريحة.

ضع 25 µL من خليط التفاعل الكامل في كل قسم. ضع غطاءً بلاستيكياً فوق القسم، ثم ضع الشريحة في غرفة رطبة. احمِ الشريحة من الضوء عن طريق تغليف الغرفة بورق الألومنيوم، واتركها لتحضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

على الرغم من إمكانية ملاحظة إشارات كل من الليغاز والـ topo بعد فترة حضانة مدتها ساعة واحدة، إلا أنه يمكن في كثير من الحالات تعزيز إشارة الليغاز بشكل أكبر. ولتعزيز الإشارة، أعد تطبيق مزيج التفاعل بدون vac topo والأوليغونوكليوتيد one، ولكن مع الأوليغونوكليوتيد three و T four DNA Ligase، ثم ضع غطاءً بلاستيكياً على المقطع واحضنه في غرفة مرطبة لمدة 18 ساعة. وفي اليوم التالي، وفي درجة حرارة الغرفة، اغمر الشريحة برفق وبشكل رأسي في وعاء coplan يحتوي على ماء بدرجة حرارة الغرفة لإزالة الغطاء البلاستيكي.

بعد ذلك، اغسل المقطع بالماء المقطر ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة. اشطف المقطع بمحلول بيكربونات الصوديوم المنظم. يعمل شطف هذا المحلول القلوي على تعزيز فلورية fitzy، وهي حساسة لـ pH وتنخفض بشكل ملحوظ عندما تكون قيمة pH أقل من سبعة.

أخيراً، قم بتغطية القطاع بمحلول مضاد للتلاشي يحتوي أيضاً على DPI لعد النوى وصبغها، ثم ضع شريحة التغطية. أصبحت القطاعات الآن جاهزة للفحص بالمجهر الفلوري. يظهر في هذا الشكل قطاع نسيجي من غدة زعترية معالجة بالديكساميثازون حيث رصدت الآلة الجزيئية كسور DNA ذات نهايات غير حادة من النوع DNAs one و DNAs two في المناطق القشرية للغدة الزعترية التي تمر بعملية الموت الخلوي المبرمج، حيث يشير الفلورسنت السيتوبلازمي الأخضر إلى كسور من نوع DNA's two، والتي تميز البلاعم القشرية التي تهضم المواد النووية للخلايا الزعترية الميتة مبرمجاً.

تنتج هذه الإشارة بواسطة vac topo وتتركز في ليزوسومات FGA التي تحتوي على DNA ذي هيدروكسيل في الطرف الخماسي. تشير الفلورة الحمراء لكسور السلسلة المزدوجة إلى علامات نوع واحد من كسور DNA، في نوى الخلايا التيموسية المبرمج موتها والتي لم تبتلعها البلاعم. تخضع أعداد هائلة من الخلايا التيموسية للموت الخلوي المبرمج في آن واحد.

يصاحب ذلك تكوين خمسة كسور مزدوجة الشريط في الفوسفات الأولي تم تصورها عن طريق الوسم المعتمد على الليغيز. تقع هذه الكسور عند المحيط النووي وتشكل أنماطاً حلقية الشكل. تظهر جميع النوى الخلوية باللون الأزرق من خلال التصبيغ المضاد باستخدام dpi.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر عدم السماح للمقاطع بأن تجف بين إضافات المحاليل المختلفة. كما يجب الحفاظ على جميع التحضيرات الإنزيمية على الثلج قبل إضافتها للمقاطع، وحماية المجسات الفلورية من الضوء أثناء تفاعل الوسم وبعد تطويره. وقد سمحت هذه التقنية بتصور جميع مراحل تفكك الخلايا الهجينة.

يُعد هذا المستشعر في حد ذاته مثالاً على نهج التكنولوجيا النانوية الخضراء في تصميم الجسيمات والمجسات والآلات النانوية. يجمع هذا النهج بين المكونات الاصطناعية وأجزاء الآلات الجزيئية الموجودة طبيعياً. والهدف من ذلك هو القضاء على السمية والتفاعلية البيولوجية الضارة لهذه المواد النانوية عالية التشتت.