تحضير العينة من

تهدف هذه التجربة إلى تحليل المستخلصات الخالية من الخلايا لبكتيريا Mycobacterium tuberculosis باستخدام الميتابولوميات بالرنين المغناطيسي النووي (NMR)، وذلك عن طريق استزراع البكتيريا أولاً وحصاد الخلايا في مرحلة النمو المناسبة، ثم تحليل الخلايا والحصول على مستخلصات خالية من الخلايا للتحليل. بعد ذلك، يتم إعادة تعليق المستخلصات المجففة بالتجميد في محلول منظم لإجراء تحليل NMR.

أخيرًا، قم بجمع بيانات الرنين المغناطيسي النووي (NMR) وتحليل الأطياف باستخدام البرامج المتخصصة لتحديد المستقلبات. وفي النهاية، يُستخدم تحليل NMR لبكتيريا *Mycobacterium tuberculosis* لإظهار الحفاظ على مستويات المستقلبات عند التعرض لمعالجات مختلفة. ويمكن تطبيق الميتابولوميات القائمة على NMR على الجوانب الرئيسية لفسيولوجيا *Mycobacterium tuberculosis*، مثل المسارات الأيضية المهمة.

يعد هذا الفهم أمراً بالغ الأهمية لتوضيح آليات عمل الدواء ومقاومته، ولتحديد أهداف جديدة لتصميم الأدوية. وبوجه عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة بسبب عدم القدرة على التعامل مع جميع العينات بنفس الطريقة تماماً، مما سيؤدي إلى إدخال تباينات غير ضرورية في النتائج من مختبري. وسيقوم ستيفن لوكا، طالب الدكتوراه، بشرح إجراءات التعامل مع العينات لمعالجتها بواسطة NMR من مختبري، ثم سيقوم مدير مختبر الأبحاث وروبرت فينتون، فني أبحاث (المستوى الثالث)، بتوضيح إجراءات التعامل مع مستنبتات mycobacterium tuberculosis عند إجراء تجارب M tuberculosis.

اتبع البحث ممارسات المستوى الثالث من السلامة البيولوجية وفقًا للإرشادات المؤسسية. وعلى الرغم من أن الملصقات في هذا الفيديو تشير إلى microbacterium tuberculosis لاعتبارات السلامة البيولوجية، إلا أن هذا العرض التوضيحي استخدم سلالة mycobacterium magmatic غير الممرضة. ابدأ بإذابة مخزون glycerol بنسبة 50% من M tuberculosis على الثلج.

قم بتلقيح 0.15 milliliters في 110 milliliters من مرق M-A-D-C-T-W في دورق ER سعة 250 milliliter، ونمّ المزارع عند 37 degrees Celsius مع الرج بسرعة 100 RPM لمدة ستة أيام تقريبًا. إذا لم تكن هناك حاجة لمضادات حيوية أو إضافات بديلة أو معالجات أخرى، فقم بحصاد المزارع؛ أما بالنسبة للمزارع التي تتطلب معالجات، فقم بحصادها وفقًا لذلك.

احتفظ بـ 0.5 milliliter من Eloqua على الثلج لأغراض الزرع والمعايرة ومراقبة الجودة. ثم قم بإجراء المعالجة المطلوبة وأعد المزارع إلى الهزاز بعد انتهاء فترة المعالجة. اسحب 1 milliliter وقم بتحديد OD 600.

كذلك، احتفظ بعينة بحجم 0.5 مل للزراعة، والمعايرة، ومراقبة الجودة. حافظ على الخلايا في الثلج طوال الفترة المتبقية من البروتوكول. قم بحصد الخلايا في أربعة أنابيب سعة 50 مل عن طريق الطرد المركزي بعد الغسل بـ 15 مل من الماء المقطر مرتين والمبرد بالثلج.

قم بتعليق الكريات في حصص مقدار كل منها 10 milliliter. اسحب حصتين وقم بترسيب الكريات عن طريق الطرد المركزي، ثم أعد تعليق كريات الخلايا في حجم نهائي قدره one milliliter من الماء المقطر مرتين. إذا كان المطلوب الحصول على معلق خلوي مفرد خالٍ من التكتلات، فمرر الخلايا عبر إبرة بقياس 27 gauge.

قم بنقل 1 mL من معلق الخلايا ثلاث مرات إلى أنابيب سعة 2 mL ذات غطاء لولبي تحتوي على مصفوفة التحلل B. ضع جهاز التجانس والتحلل fast prep 24 داخل كابينة السلامة البيولوجية. ضع العينات في حامل العينات مع تثبيت لوحة قضبان الاحتجاز. ثم قم بالمعالجة لمدة 60 ثانية عند ضبط السرعة على 6 m/s.

بعد ذلك، قم بطرد العينات مركزياً لترسيب حطام الخلايا والخلايا السليمة. ثم مرر السائل العلوي عبر مرشح حقنة بمسامية 0.2 micron في أنبوب معقم للتأكد من خلوه من الخلايا الحية. ازرع 0.1 milliliter من العينة على MADC.Agar.

قم بتجميد العينات في حمام من الإيثانول والثلج الجاف، ثم خزنها في درجة حرارة 80- درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للتجفيد والمعالجة في مرفق NMR. بعد مرور شهرين، افحص الأطباق للتحقق من خلوها من الوحدات المكونة للمستعمرات. في حال عدم وجود CF user، يمكن نقل العينات من مختبر BSL three لإجراء مزيد من التحليلات في مرفق NMR قياسي.

بعد تجفيف العينات تماماً، أعد تعليقها في 0.7 milliliters من محلول NMR المنظم وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق، ثم قم بالطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق عند 13,000 ×g. اسحب 0.6 milliliters وانقلها إلى أنبوب NMR بحجم خمسة مليمترات. ومن خلال تحليل الوسائط، يسهل استخدام حامل مخصص تحميل عدة أنابيب NMR في أجهزة التدوير بالعمق الصحيح.

بعد ذلك، انقل العينات إلى جهاز مطياف NMR لإدخالها في مغير العينات A-B-A-C-S one الذي يتسع لـ 20 عينة، مع التبادل بين المزارع غير المعالجة والمزارع المعالجة بالعقار. يجب تحميل العينة الأولى مسبقاً في المغناطيس عند بدء التشغيل الآلي.

لمعايرة الجهاز، قم بتحسين طول النبضة بزاوية 90 درجة باستخدام عينة واحدة، ثم قم بضبط الجهاز لبقية العينات. استخدم أيقونتي NMR و grad shim. قم بأتمتة عمليات التثبيت (locking) والضبط (shimming) وجمع بيانات NMR لكل عينة.

بالنسبة لطيف الرنين المغناطيسي النووي أحادي البعد للهيدروجين (1D 1H NMR)، اختر تسلسل النبضات مع كبت إشارة الماء والنحت التحفيزي (excitation sculpting). اضبط إجمالي 32,000 نقطة بيانات، و128 مسحاً، و16 مسحاً وهمياً لطيف 2D 1H-13C HSQC. اختر تسلسل النبضات.

اختر إجمالي 2048 نقطة بيانات مع عرض مسح على طول البعد المباشر H one و64 نقطة بيانات مع عرض مسح على طول البعد غير المباشر C 13. حدد أيضاً تجميع الطيف بـ 128 مسحاً و16 مسحاً وهمياً للحصول على نسبة إشارة إلى ضجيج جيدة. وقد أنتج طيف m tuberculosis ما يقارب 400 قمة، بما في ذلك 50 مستقلاً أيضياً معروفاً.

على سبيل المثال، أدت معالجة البيانات كما هي مفصلة في المخطوطة المرفقة إلى إنتاج هذا الطيف من المستقلبات المرتبطة بشكل مباشر أو غير مباشر بمسار D alanine. وتتناسب قوة شدة القمم طردياً مع تركيزات المستقلبات الموجودة في مستخلص الخلية، لذا يمكن قياس الاضطرابات النسبية في المستقلبات والمسارات الاستقلابية بين العينات والمعالجات. يمهد تحليل LMR metabolomics الطريق للباحثين في مجال علم البكتيريا لاستكشاف الفسيولوجيا والإمراض في البكتيريا الدقيقة والمرئية وغيرها من الكائنات الدقيقة الممرضة أو غير الممرضة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير مستخلصات خلوية متعددة لبكتيريا السل من أجل تحليل الميتابولوميات باستخدام الرنين المغناطيسي النووي (NMR)، والأهم من ذلك، كيفية الحفاظ على الاتساق طوال البروتوكول بأكمله للحصول على نتائج موثوقة.