تحديد نشاط السامة للخلايا الأمثل للHer2neu CD8 خلايا تي محددة الإنسان من خلال مقارنة الفحص الإصدار Cr51 إلى نظام xCELLigence

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد نشاط الخلايا التائية السامة للخلايا من خلال مقارنة نهج يعتمد على الممانعة باستخدام نظام EXOGEN مع مقايسة تحرر الكروم. يتم تحقيق الخطوة الأولى عن طريق فصل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي من الدم الكامل باستخدام fial. بعد ذلك، تُضاف الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC) إلى الآبار جنباً إلى جنب مع المستضد الببتيدي، وIL two المؤتلف البشري، وخلايا PBMC المشععة لإنشاء خلايا T ذات CD eight النوعية للمستضد.

يتم بعد ذلك استزراع الخلايا التائية CD8 النوعية للمستضد مع الخلايا الورمية في كلا المقايسين لإحداث موت الخلايا الورمية. ويتم الحصول على نتائج تظهر النسبة المئوية لتحلل الخلايا الورمية باستخدام كل من طريقة المعاوقة ومقايسة تحرر الكروم. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل مقايسة تحرر الكروم في أن النظام القائم على المعاوقة يجمع بيانات في الوقت الفعلي ويتطلب عدداً أقل من الخلايا التي لا تحتاج إلى أي وسم. وفي هذا البروتوكول، يوفر الدم المأخوذ من متبرعين أصحاء طبيعيين إيجابيي HLA A2 مصدراً لخلايا pbmc أو الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة.

استخدم F call PA plus لفصل خلايا P BMCs من الدم. بعد ذلك، قم بتحميل ما يقرب من 4 مليون خلية P BMCs في أطباق سداسية الآبار بمعدل 2 ملليلتر من الوسط الغذائي لكل بئر. أضف إلى كل بئر ببتيد HLAA two binding للوصول إلى تركيز نهائي قدره 10 µg/mL في المزرعة.

تُعامل الخلايا في أيام متبادلة للمساعدة في تحفيز وتوسيع الخلايا التائية. أضف وسطاً غذائياً جديداً مكملاً بـ IL two البشري المؤتلف ليصل إلى تركيز نهائي قدره 50 units/mL. بعد مرور أسبوع، قم بتحضير مزرعة من pbmc ذاتية، ثم عرض الخلايا للإشعاع وقم بتحفيزها لمدة ساعتين باستخدام نفس الـ hla.

أضف ببتيد الربط الثنائي بتركيز 10 micrograms per milliliter لإعادة تحفيز المزارع عن طريق إضافة 1 milliliter من خلايا PBM CS الذاتية المشعة إلى كل بئر. استمر في إضافة وسط غذائي طازج مُدعم بـ IL two في أيام متبادلة، وبعد مرور أسبوع آخر، أعد تحفيز المزارع بنفس الطريقة للمرة الثانية. وبعد ستة أيام إضافية من الزراعة، ستكون الخلايا جاهزة للاستخدام.

قم بتجهيز محطة قياس الممانعة الذكية للاستخدام عن طريق موازنتها عند 37 °C تحت 5% carbon dioxide لمدة ساعة واحدة على الأقل. يتم حصاد خلايا ورمية بشرية ذات تلاقي بنسبة 75% باستخدام 0.25% trypsin والطرد المركزي. قم بعد الخلايا الورمية باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer) وأعد تعليقها في وسط RPMI.

وسط الورم بتركيز 7,500 خلية لكل µL. في البرنامج التالي، قام برنامج وكيل Excel بإعداد صفحة التخطيط مع تخطيط الآبار. قم بإعداد صفحة الجدول الزمني لأخذ قراءات المعاوقة كل خمس دقائق لمدة 40 ساعة؛ وخلال أول 18 ساعة، سيقوم نظام Xceligent بأخذ قراءات المعاوقة لخلايا الورم فقط.

ثم أضف 100 µL من وسط RPMI المخصص للأورام في كل بئر. قم بأخذ قراءة خلفية لـ EPLs عن طريق قياس المعاوقة في غياب الخلايا. وبعد إضافة الخلايا الورمية، ضع الأطباق في المحطة وابدأ في أخذ القراءات.

ستبدأ الخلايا الورمية في الالتصاق فوراً بـ EPLs. وبعد حوالي 18 ساعة من التحضين، ستكون الخلايا الورمية قد التصقت بـ EPLs وتضاعف عددها ليصل إلى 15,000 خلية ورمية في كل بئر. في هذا الوقت، يتم حصاد خلايا T المُجهزة عن طريق الكشط اللطيف والطرد المركزي مع الرج.

أعد تعليق الخلايا التائية (T cells) في وسط RPMI مع 10%FBS وقم بعدها باستخدام مقياس خلايا الدم (hemo cytometer). وبمجرد معرفة كثافة الخلايا، قم بإعداد سلسلة تخفيف مضاعفة للخلايا التائية بحيث يكون أعلى تركيز هو 40 T cells لكل خلية ورمية عند إضافة 200 µL من الخلايا التائية إلى الخلايا الورمية. ويجب أن يوفر التخفيف الأخير من السلسلة 1.25 T cells لكل خلية ورمية.

أوقف محطة EXOGEN مؤقتًا وقم بإزالة EPL باستخدام ماصة. قم بإزالة الوسط من الآبار، ثم حمّل 200 µL من الخلايا التائية T cells باستخدام جميع التركيزات من سلسلة التخفيف كضابط سلبي. استخدم وسطًا نقيًا، وأعد EPL إلى المحطة وتابع البرنامج عند نهاية المقايسة.

قم بتنميط النتائج. اتبع دائمًا إجراءات السلامة الإشعاعية المؤسسية عند التعامل مع الكروم 51 والخلايا المستهدفة الموّسمة بالكروم 51، واستخدم الدروع الواقية لتقليل التعرض للإشعاع. ابدأ بتحفيز الخلايا الورمية نبضيًا لمدة ساعتين بتركيز 1 million cells per milliliter مع إضافة 10 µL per milliliter من الكروم 51 الطازج.

بعد ذلك، يتم غسل خلايا الورم في 10 milliliters من وسط RPMI المحتوي على 10%FBS، ثم تُطرد الخلايا مركزياً وتُعاد تعليقها في الوسط نفسه بتركيز مليون خلية لكل milliliter. بعد ذلك، تُضاف 100,000 خلية ورمية لكل بئر في طبق ذو قاع مستدير يحتوي على 96 بئراً لحساب التحلل التلقائي.

لا تضف أي شيء آخر إلى ست من هذه الآبار، وكذلك إلى ست آبار أخرى. أضف 100 µL من Triton X 100 إلى جميع الآبار المتبقية لتحليل الخلايا، وبالتالي حساب الحد الأقصى للتحرر. أضف الخلايا التائية (T-cells) إلى الطبق باستخدام سلسلة التخفيف التي تم تحضيرها مسبقاً.

قم الآن بتحضين الأطباق لمدة خمس ساعات، واجمع عينات بحجم 50 µL من السائل الطافي من كل طبق، ثم قم بتحميل العينات على طبق luma بعد تجفيف الأطباق في غطاء التدفق الصفحي طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. قم بقياس CPM الخاصة بها باستخدام عداد غاما لخلايا T-cell و SKBR three. تم استزراع الخلايا السرطانية على أطباق X intelligence وقياس مؤشر الخلية، والذي يعكس معاوقة الطبق لأن خلايا T cells لا تتطلب الالتصاق من أجل التكاثر.

كان تأثيرها على المعاوقة ضئيلاً على مدار 40 ساعة من الزرع. أظهرت الخلايا السرطانية المزروعة بمفردها زيادة في قياس المعاوقة. ومع ذلك، فإن إضافة الخلايا التائية عند 18 ساعة يؤدي إلى تعطيل هذا الاتجاه.

يتطلب هذا الحدث تسوية برمجية بعد إضافة الخلايا التائية (T cells)، وسيتم استقصاؤه بشكل أكبر في التجربة التالية. عندما تم استزراع خلايا SK BR three مع تركيزات متفاوتة من الخلايا التائية، كان الانخفاض في الممانعة يعتمد بشكل واضح جداً على جرعة الخلايا التائية، حيث تم جمع البيانات كل خمس دقائق على مدار ثلاث تجارب عند علامة 10 ساعات. اتبعت مؤشرات الخلايا حدودية من الدرجة الثانية عبر نطاق الخلايا التائية، مما يشير إلى أن محطة Exogen ترصد موت أورام SK B three بوساطة خلايا CD eight التائية في الوقت الفعلي على شكل انخفاض في مؤشر الخلايا، وذلك لتحديد ما إذا كانت انخفاضات الممانعة في SK BR three بواسطة الخلايا التائية نوعية للمستضد.

تم استزراع خلايا SK KBR 3 مع خلايا T متخصصة في FLU وإيجابية لـ HLA A 2 والتي لا تتعرف على HER 2 neu. أظهرت هذه الخلايا نشاطاً تحللياً أقل بكثير، ولتحديد ما إذا كانت خلايا T المتخصصة في HER 2 neu تقوم بالقتل بطريقة نوعية للمستضد، تم دمج أجسام مضادة لـ Fas ligand في المزارع المشتركة. ولم تؤدِ الأجسام المضادة إلى تقليل النشاط التحللي لخلايا T المتخصصة في HER 2 neu P 360 9.

ومع ذلك، في حالة الخلايا T التي تم تنشيطها بشكل غير نوعي باستخدام حبيبات anti CD three و CD 28، ثبط الجسم المضاد عملية التحلل لتحديد ما إذا كانت عملية القتل تحدث بطريقة تعتمد على HLA class one. حيث تمت إضافة إما الجسم المضاد anti HLA class one أو الجسم المضاد الضابط من النوع المتماثل (isotype control antibody) إلى المزارع المشتركة. وقد دعمت النتائج هذه الفرضية بقوة.

بعد ذلك، تم استزراع الخلايا التائية بشكل مشترك مع خلايا سرطانية أخرى بنسبة واحد إلى خمسة. استُخدم خط الخلايا الورمية BT 20 السلبي لـ HLA A two كعينة ضابطة سلبية. وتُظهر النتائج أن هذه الطريقة مفيدة للتعامل مع العديد من الخلايا الورمية الملتصقة المستهدفة.

أضيفت المزارع المشتركة من خليتي T المحددتين لـ P 360 9 الجديدتين في HER إلى خلايا مستهدفة موسومة بالكروم 51، ثم تلى ذلك تحليل CRA. يبدو أن المقايسة الاستخباراتية أكثر حساسية لتحليل الاتساق. تم حساب التباين داخل المقايسة كنسبة مئوية لمعامل الاختلاف عند كل نسبة خلوية بين 1:40 و 1:5.

وقد تم قياس هذه القيمة بأقل من 15% عند أدنى نسب للخلايا. ومع ذلك، كانت النسبة المئوية لمعامل الاختلاف (CV) مرتفعة أو غير قابلة للتنبؤ. بالإضافة إلى ذلك، تم فحص تباين تحلل خلايا T لـ SK BR three عن طريق الزراعة المشتركة مع خطوط خلوية مختلفة من خلايا T النوعية لـ P 360 9.

تم توليد البيانات بفاصل زمني قدره 30 يوماً. أُجريت المقايسات في ثلاث مكررات وكانت النتائج متشابهة جداً. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية تحديد نشاط الخلايا التائية السامة للخلايا باستخدام خلايا CD eight T النوعية للمستضد وخلايا ورمية، وذلك باستخدام نهج قائم على الممانعة.