كشف إزفاء السمية في العصارة الخلوية المضيف بواسطة الرنين مأكل السطح

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن مجموعة السموم التي تدخل إلى السيتوسول وقياس كميتها. ولتحقيق ذلك، يتم أولاً ربط السموم بسطح الخلية المضيفة عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، يتم إزالة السموم غير المرتبطة ويتم تدفئة الخلايا إلى 37 °C، مما يسمح بانتقال السموم إلى نظام الغشاء الداخلي، ومن ثم إلى سيتوسول الخلية المضيفة. ثم يُستخدم الديجيتونين لنفاذ الغشاء البلازمي بشكل انتقائي بعد عملية نفاذ الخلايا.

يتم تقسيم مستخلصات الخلايا إلى أجزاء منفصلة من الغشاء والسيتوسول باستخدام الطرد المركزي التفاضلي، وكخطوة نهائية، يُستخدم رنين البلازمون السطحي SPR للكشف عن دخول السموم إلى السيتوسول وتقدير كميتها، وذلك عن طريق تمرير جزء السيتوسول فوق مستشعر SPR مغطى بجسم مضاد للسم. ستساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال بيولوجيا السموم، مثل كفاءة وحركية دخول السموم إلى السيتوسول، وكمية السموم التي تدخل السيتوسول، والتثبيط الدوائي المحتمل لانتقال السموم إلى السيتوسول. قبل البدء في هذا البروتوكول، قم بتجهيز خلايا HeLa لتسميم الخلايا كما هو موضح في البروتوكول المكتوب، وذلك بعد تحضين خلايا HeLa طوال الليل.

استبدل وسط الزرع بـ 1 mL من DMEM الذي يحتوي على 100 ng/mL من Ganglioside GM1 واحضن العينة لمدة ساعة واحدة عند 37 °C. يؤدي ذلك إلى زيادة عدد مواقع الارتباط لسم الكوليرا، حيث سيتداخل مستقبل GM1 الخاص بالسم في الغشاء البلازمي للخلايا المعرضة لمحلول GM1.

بعد تحضين لمدة ساعة واحدة، قم بإزالة الوسط الموجود في الـ GM one واغسل الخلايا مرتين باستخدام DMEM. بعد ذلك، أضف واحد ملليلتر من DMEM الذي يحتوي على واحد ميكروغرام لكل ملليلتر من ذيفان الكوليرا، وضع الخلايا عند درجة حرارة 4 °C لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة الوسط المحتوي على الذيفان واغسل الخلايا مرتين.

بعد ذلك، يتم تحضين الخلايا في 1 مل من DMEM عند 37 °C للمدة المطلوبة. وفي نهاية كل فترة مطاردة (chase period)، تُغسل الخلايا باستخدام PBS، ثم يتم تحضين كل بئر بـ 250 µL من EDTA بتركيز 0.5 mM وPBS. وبعد تحضين لمدة 10 دقائق على الثلج، تُزال الخلايا من طبق الستة آبار عن طريق التrituration القوي باستخدام ماصة P 1000.

بعد جمع الخلايا من البئر الأولى، ادمجها مع البئر الثانية ثم الثالثة من نفس المجموعة التجريبية. بعد ذلك، ضع معلق الخلايا المدمج من الآبار الثلاثة المكررة في أنبوب طرد مركزي دقيق واحد. ثم قم بتدوير أنبوب الطرد المركزي الدقيق في جهاز طرد مركزي دقيق مكتبي لمدة خمس دقائق.

يجب الحصول على كتل خلوية ذات حجم متكافئ تقريباً لجميع الظروف عند 5,000 ×g. تخلص من السائل الطافي ثم أعد تعليق الكتلة الخلوية في 100 µL من محلول عمل بتركيز 0.04% من digitonin محضر مسبقاً ومبرد. ضع معلق الخلايا على الثلج لمدة 10 دقائق، ثم استخدم جهاز طرد مركزي دقيق (micro centrifuge) لتدوير الخلايا المنفذة بـ digitonin عند 16,000 ×g لمدة 10 دقائق.

انقل الجزء العلوي الطافي (supinate) الذي يحتوي على السيتوسول إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد، واحتفظ بالجزء المترسب (pellet) الذي يحتوي على العضيات. يتم تحضير معايير سم SPR بتركيزات 110 و1 و0.1 nanograms per milliliter في محلول HCN المنظم، ويتم تحضير العينات عن طريق تخفيف أجزاء الـ supinate التي تحتوي على السيتوسول في محلول HCN المنظم حتى يصل الحجم النهائي إلى 1 milliliter. من الضروري أن تكون أحجام العينات 1 milliliter على الأقل لضمان تفريغ الهواء من حلقة العينة التي تبلغ سعتها 500 microliter قبل الحقن. أما أجزاء الـ pellet التي تحتوي على العضيات فيتم إعادة تعليقها في 1 milliliter من محلول HCN المنظم الذي يحتوي على 1% Triton X 100.

تعد إضافة المنظف ضرورية لتحرير تجمع السموم المحاط بالغشاء. قم أيضاً بتحضير مجموعات متوازية من الكسور السيتوزولية وكسور العضيات كجزء من تجربة ضابطة للتأكد من دقة إجراء الفصل التجزيئي؛ أعد تعليق الكسر السيتوزولي في 20 µL من منظم عينات بتركيز أربعة أضعاف (four x)، والكسر العضياتي في 120 µL من منظم عينات بتركيز ضعف واحد (one x)، ثم افصل أحجاماً متكافئة من كل كسر باستخدام الفصل الكهربائي للهلام بـ sodium dodecyl sulfate وpolyacrylamide، وقم بالكشف بواسطة تحليل Western blot لإثبات توزيع بروتين سيتوزولي في الكسر الطافي وبروتين شبكة إندوبلازمية خشنة ذائب في كسر الراسب. ولتحضير شريحة SPR، قم أولاً بتركيب شريحة زجاجية مطلية بالذهب مع طبقة أحادية ذاتية التجمع في جهاز SPR.

قم بتنشيط شريحة المستشعر عن طريق تمرير محلول E-D-C-N-H-S فوق الشريحة لمدة 10 دقائق بمعدل تدفق قدره 41 microliters per minute. وفي جميع عمليات التمرير اللاحقة، نستخدم معدل التدفق نفسه. ثم قم بإزالة محلول تنشيط E-D-C-N-H-S عن طريق غسل اللوح لمدة خمس دقائق باستخدام PBS يحتوي على 0.05%2020.

يحتوي الطبق الآن على روابط MI تفاعلية نتيجة لإزالة الغطاء بواسطة محلول E-D-C-N-H-S. بعد ذلك، يتم تروية جسم مضاد لـ CTA فوق شريحة الاستشعار المنشطة بتخفيف بنسبة 1 إلى 20,000 في خلات الصوديوم بتركيز 20 millimolar لمدة 15 دقيقة. سيُلاحظ انخفاض أولي في وحدة معامل الانكسار، والتي تُختصر بـ RIU، بسبب التغير في pH.

سيتبع ذلك زيادة في وحدات معامل الانكسار (RIU) مع التقاط الأجسام المضادة بواسطة الروابط التساهمية الأميدية التفاعلية. وفيما يخص شريحة المستشعر، يتم إزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة من شريحة المستشعر عن طريق غسلها بمحلول PBST لمدة خمس دقائق. ستصل إشارة RIU الناتجة عن الأجسام المضادة التي تم التقاطها إلى مرحلة الثبات والاستقرار، مما يوفر إشارة خط أساس جديدة.

كخطوة نهائية في تحضير الشريحة، قم بضخ إيثانولامين بتركيز 1 molar فوق شريحة المستشعر لمدة خمس دقائق. تعمل هذه الخطوة على سد وتعطيل أي روابط غير مرتبطة متبقية على شريحة المستشعر. ستزداد إشارة RIU لتحديد قراءة خط الأساس؛ قم بضخ PBST فوق المستشعر المطلي بالأجسام المضادة لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، يتم تمرير عينة تجريبية أو معيار للسم فوق المستشعر لمدة 300 ثانية. يتم إخراج الربيطة من المحلول المنظم وتمرير PBST فوق المستشعر لمدة 200 ثانية أخرى. ويتم إزالة أي سم يظل مرتبطاً بالمستشعر عن طريق غسلة ثانية بـ PBST عند pH 5.0.

سيؤدي ذلك إلى إعادة الإشارة إلى قراءة خط الأساس الأولية، مما يسمح بمعالجة عينة أخرى على المستشعر نفسه. قبل تحميل عينة جديدة، ادفع كمية صغيرة من الهواء عبر حلقة العينة لطرد أي سائل متبقٍ من العينة السابقة. بعد عملية الاستحواذ.

يمكن تحليل البيانات باستخدام برنامج scrubber two، ويمكن استخدام برنامج Igor لإعداد الأشكال التوضيحية. يُعد ذيفان السعال الديكي ذيفاناً من النوع AB ينتقل من سطح الخلية إلى الشبكة الإندوبلازمية قبل أن تدخل السلسلة α الخاصة بـ PTs one إلى السيتوسول.

يمكن لمقايسة الانتقال القائمة على رنين البلازمون السطحي (SPR) الكشف عن بروتينات PTs في سيتوسول خلايا CHO المتسممة. لم يتم توليد أي إشارة من سيتوسول الخلايا غير المتسممة، مما أكد تخصص الأجسام المضادة لـ PTs. لم يحدث تفاعل تبادلي لأحد الأجسام المضادة مع أي مكون من مكونات سيتوسول المضيف.

جزء السيتوسول من الخلايا التي تعرضت للتسمم بوجود felden. كما فشل A في إنتاج إشارة إيجابية، ويمنع BFA نقل السموم إلى موقع انتقال الشبكة الإندوبلازمية (ER)، وبالتالي يمنع وصول السلسلة H إلى السيتوسول. ويعد Chole toin سمًا آخر من النوع AB ينتقل عبر الشبكة الإندوبلازمية.

تم اكتشاف CTA one في الجزء السيتوسولي من خلايا helo المعالجة بـ CT. وقد أكد ذلك أن المنهجية تعمل مع أنواع متعددة من الخلايا ويمكن تطبيقها على أي سم يتوفر له جسم مضاد للسلسلة. لم يتم اكتشاف أي إشارة عند تمرير الجزء السيتوسولي من الخلايا المعالجة بـ CT فوق مستشعر SPR مغطى بجسم مضاد لـ CTB، مما يثبت أنه على عكس الوحدة الفرعية CT A one، فإن خماسي CTB المرتبط بالخلية لا يدخل السيتوسول.

بعد التمرير فوق مستشعر SPR مطلي بجسم مضاد لـ CTA. وتظهر الإشارة الناتجة عن جزء العضيات خارج نطاق المقياس مقارنةً بالإشارة الأضعف الناتجة عن الجزء السيتوسولي. وهذا يتفق مع عدم الكفاءة المعروفة لنقل CT إلى موقع الانتقال في الشبكة الإندوبلازمية ER، مما يحد بدوره من كمية السم التي يمكن أن تصل إلى السيتوسول.

يمكن أيضاً مراقبة التراكم المعتمد على الوقت للسم السيتوزولي المنقول. بعد تعريض الخلايا لـ CT عند درجة حرارة 4 °C، لم يتم الكشف عن أي سم في السيتوزول بعد 15 دقيقة من التسخين إلى 37 °C.

تم رصد كمية صغيرة من السم السيتوزولي بعد 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، ورُصدت كميات أكبر تدريجياً من السم السيتوزولي بعد فترات مطاردة مدتها 45 و60 دقيقة. وهذا يثبت الاستمرار في نقل السم المرتبط بالخلية إلى السيتوزول المضيف على المدى الطويل. يمكن للمقايسة أيضاً رصد تثبيط انتقال السم إلى السيتوزول؛ حيث أظهرت الخلايا المعالجة بـ 10%DMSO مستويات منخفضة من CT1 الشبيه بالسيتوزول مقارنة بالخلايا الضابطة المسمومة غير المعالجة التي حدث فيها انفكاك للسم.

تُعد السلسلة شرطاً أساسياً للانتقال إلى العصارة الخلوية، لذا فإن استقرار CT A one الناجم عن DMSO منع بالتالي حركته من الشبكة الإندوبلازمية إلى العصارة الخلوية. ولتقدير حظر انتقال السموم الناجم عن DMSO، استُخدم منحنى قياسي تم إنشاؤه من تركيزات معروفة من السموم لحساب تركيز cta, one في العصارة الخلوية، والذي بلغ 0.3 nanograms per milliliter للخلايا غير المعالجة، و 0.1 nanograms per milliliter للخلايا المعالجة بـ DMSO. وبذلك، أدى تثبيط تفكك CT A one بواسطة DMSO إلى انخفاض بمقدار ثلاثة أضعاف في انتقال CTA one من الشبكة الإندوبلازمية إلى العصارة الخلوية.

باتباع هذا الإجراء، سنتمكن من استخدام تقنيات أخرى، مثل مقايسات التسمم، لإقامة صلة مباشرة بين كمية السم الموجودة في العصارة الخلوية ونشاط السم.