التحليلية تقنيات يعاير النيتريك النشاط الحيوي أوكسيد

الهدف العام من التجربة التالية هو توضيح كيفية الكشف الدقيق والنوعي عن نواتج أيض أكسيد النيتريك في العينات البيولوجية. ويتم تحقيق ذلك من خلال معالجة عينات الدم فور جمعها لمنع فقدان نواتج الأيض أو تكون شوائب اصطناعية. وبالتزامن مع ذلك، يتم إجراء عملية حصاد سريعة وفعالة للأنسجة لتقليل آثار البيئة الناقصة الأكسجين على نواتج أيض أكسيد النيتريك.

يتم جمع حلقات الشريان الأبهر وتعليقها في حمام عضوي لتقييم وظائف البطانة الغشائية. علاوة على ذلك، تُستخدم المقايسات الكيميائية الحيوية لتقدير مستويات النترات، ومستويات النتريت، والمستويات النسبية للنيتروثيولات ومنتجات النترات الأخرى في النسيج. ومن خلال استخدام هذه المقايسات، يمكن لإجراء مقارنة دقيقة بين الحيوانات التجريبية وحيوانات المجموعة الضابطة أن يوفر معلومات قيمة حول إنتاج وأيض أكسيد النيتريك.

تتمثل الميزة الرئيسية لاستخدام هذا النهج متعدد الأنظمة مقارنة بالطرق أو المقاييس الفردية في أنه يتيح صورة أشمل للكيمياء الحيوية لأكسيد النيتريك في أنظمة أعضاء متعددة. ومن ثم يمكننا البدء في فهم أي من هذه المستقلبات قد يكون له فائدة إنذارية أو تشخيصية، وكيف تعكس مجموعة مستقلبات أكسيد النيتريك تكوين أكسيد النيتريك البطاني ومدى توافره. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث أن كل خطوة في العملية أساسية للحفاظ على سلامة العينة.

لا تظهر بعض هذه الخطوات عند قراءة قسم الطرق في المجلات العلمية المعتادة نظراً للتفاصيل الدقيقة لعملية جمع العينات واستخلاص الأنسجة. سيقوم الدكتور Hong Jing، وهو باحث أول في مختبري، بتوضيح هذا الإجراء. لهذا البروتوكول، يجب توفير شخص أو حيوان تجارب لسحب الدم، مع التأكد من أن الحيوانات التجريبية هي التي سيتم فحص أنسجتها أيضاً.

أولاً، قم بجمع الدم الكامل عن طريق إدخال إبرة قياس 25 في الوريد الأجوف السفلي. وبمجرد جمع 500 إلى 1000 µL، قم بتروية الحيوان لإزالة ما تبقى من الدم عن طريق حقن محلول منظم فسيولوجي عبر قمة البطين الأيسر، مع السماح باستبدال الدم بالكامل بينما يخرج الدم والمحلول المنظم عبر الوريد الأجوف السفلي. يجب جمع الدم الوريدي في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 mL تحتوي على NEM وEDTA مباشرة بعد عملية الجمع.

قم بطرد الدم مركزياً عند 14,300 RCF لمدة سبع دقائق. اسحب البلازما من فوق كتلة خلايا الدم الحمراء باستخدام ماصة وانقلها إلى أنبوب منفصل. قم بتحضير عينات البلازما المعزولة لتحليل HPLC عن طريق إضافة حجم مساوٍ من الميثانول البارد إلى 50 µL من البلازما المجموعة.

قم بمزج الخليط بقوة باستخدام جهاز الـ Vortex لمدة تتراوح بين ثلاث إلى خمس ثوانٍ حتى يصبح عكراً. بعد ذلك، قم بطرد الخليط مركزياً عند 14,300 RCF لمدة سبع دقائق. ولترسيب بروتينات البلازما، اجمع السائل العلوي في أنبوب منفصل سعة 1.5 milliliter واحفظه عند درجة حرارة 4 °C حتى يحين وقت تحليله.

لتحضير البلازما لتحليل التلألؤ الكيميائي، خذ حجم البلازما المتبقي، والذي يجب أن يتراوح بين 200 إلى 400 µL وقسمه إلى حجمين. قم بتحضير نصف كمية البلازما بإضافة 10% من حجم كبريتيد محمض بنسبة 5%، والانتظار لمدة 10 دقائق. هذه العينة الآن جاهزة لتحليل CLD.

قم بتحضير النصف الآخر من البلازما عن طريق إضافة 10% من حجم كلوريد الزئبق بتركيز 2% بعد مرور خمس دقائق. وفي درجة حرارة الغرفة، أضف 10% من حجم السلفوناميد المحمض. انتظر 10 دقائق أخرى ثم احقن هذه العينة في جهاز CLD كما فعلت مع البلازما.

يمكن تحضير راسب كريات الدم الحمراء (RBC pellet) لكل من تحليل HPLC وتحليل CLD. ابدأ بخلط جزء واحد من راسب الخلايا مع أربعة أجزاء من محلول التحلل منخفض التوتر (hypotonic lysis solution). قم برج الخليط جيداً باستخدام جهاز الـ Vortex لتحليل CLD.

تتم عملية تحضير الخلايا بنفس الطريقة المتبعة مع البلازما. ابدأ بإضافة حجم مساوٍ من الميثانول، ثم قم برج الخليط بقوة باستخدام جهاز الـ vortex لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس ثوانٍ، يليه وضع الخليط في جهاز الطرد المركزي لمدة سبع دقائق عند 14,300 RCF.

الآن، قم بسحب السائل الطافي باستخدام الماصة واحفظه عند درجة حرارة 4 °C حتى يتم تحليله بواسطة HPLC لتحديد مستويات نواتج أيض أكسيد النيتريك في الأنسجة. وبالنسبة للأنسجة المستهدفة من الحيوانات التجريبية، يجب أولاً جمع الدم وتحضيره كما هو موضح في القسم السابق، ويجب إجراء عملية جمع الأنسجة كالمعتاد مع إيلاء اهتمام خاص للسرعة والكفاءة لضمان عدم إصابة الأنسجة بنقص الأكسجة. وبمجرد جمعها، قم بتجنيس عينات الأنسجة بنسبة 1 إلى 5 باستخدام PBS يحتوي على N-E-M-E-D-T-A.

بعد ذلك، يتم تحضير الأنسجة المتجانسة لتحليل HPLC وCLD كما هو موضح في الأقسام السابقة الخاصة بـ RBCs. وبعد تخدير فأر بالغ باستخدام إيثر الداتيل والتأكد من عدم استجابته لقرصة إصبع القدم، يتم إجراء عملية بضع الصدر. يتم عمل شق في الخط الناصف من عظمة القص وصولاً إلى منطقة العانة للكشف عن التجويفين الصدري والبطني.

بعد ذلك، قم بإجراء تروية للحيوان باستخدام محلول كرابس-ألايت (Krebs Alite) المؤكسج. استخدم حقنة عيار 25 لحقن المحلول في قمة البطين الأيسر، مع فتح الأذين الأيمن لتوفير مخرج للدم.

بعد عملية التروية، قم بعزل الشريان الأبهر البطني عن طريق قطع وإزالة الكبد والرئتين والأنسجة الأخرى التي قد تغطي الشريان الأبهر. بعد ذلك، أمسك القلب باستخدام ملقط وقم بقطع الشريان الأبهر من الجدار الخلفي للحيوان بطريقة رفيقة. ضع القلب والشريان الأبهر في طبق بتري مملوء بالثلج.

ضع محلول كريبس المنظم البارد في الطبق. قم بقص وتنظيف الدهون والغلالة البرانية من الأبهر بعناية. تجنب إتلاف البطانة الداخلية للوعاء الدموي أثناء التنظيف.

حافظ على بطء عملية التمثيل الغذائي للشرايين الأبهرية لمنع نقص الأكسجة عن طريق نقلها إلى محلول منظم مؤكسج مبرد بالثلج كل خمس دقائق. الآن استخدم المشرط لقطع الشريان الأبهر إلى قطع حلقية بطول 3 mm. انقل القطع إلى حمام أنسجة عضوي رباعي القنوات بسعة 10 mL محمل بمحلول Krebs المنظم المؤكسج.

باستخدام مقبض المحول، قم بتطبيق شد مسبق قدره 1.5 grams على كل حلقة أورطية. ووفقاً للنتائج التجريبية، فإن 1.5 grams هو شد البداية المناسب لتحقيق الوظيفة الوعائية الحركية المثلى.

قم بمراقبة وتسجيل قياس القوة في الفأر باستخدام جسر ثماني القنوات وبرمجيات الحصول على البيانات، واترك الحلقات لتتوازن لمدة 80 دقيقة، مع تغيير المنظم كل 20 دقيقة، ثم ابدأ في التجربة. بعد توازن توتر الأنسجة، أضف 100 nanomolar من الفينيل رين (fennel rine) إلى كل حلقة لتحقيق انقباض دون الحد الأقصى. وبمجرد استقرار توتر الحلقة والوصول إلى مستوى ثابت من التوتر العضلي، قم بإجراء تحليل للاستجابة للجرعة باستخدام محفز بطاني مثل acetylcholine.

سيحدد هذا إنتاج أكسيد النيتريك ودرجة استرخاء الأوعية الدموية. بعد استجابة الجرعة للأستيل كولين، اشطف الأحواض بمحلول كريبس المنظم وأضف 100 nanomolar من مستخلص الشمر إلى كل حوض عضو لتقليص الأوعية. بعد ذلك، حدد مدى استجابة حلقات العضلات الملساء لمصدر خارجي لأكسيد النيتريك مثل نيتروبروسيد الصوديوم بوجود وغياب ODQ، وهو مثبط لإنزيم guanylyl cyclase القابل للذوبان.

سيحدد هذا النوع من النهج قيمة استرخاء بنسبة 100% للأوعية الدموية، كما يوضح الطبيعة الجوهرية لإنزيم soluble guile cyclase في التوسط في استجابة أكسيد النيتريك للاسترخاء الوعائي. وبما أن ODQ يمنع الاسترخاء الناتج عن sodium nitro IDE استجابةً لـ acetylcholine، فقد استرخت حلقات الأبهر المأخوذة من فئران مجموعة التحكم السليمة، بينما أظهرت حلقات الأبهر من الفئران التي تعاني من خلل في وظائف البطانة انخفاضاً في الاسترخاء بسبب نقص إنتاج أكسيد النيتريك. كما أُجريت مقاييس de nitro sation خاصة بالمجموعات على حيوانات التحكم عن طريق chemiluminescence لـ nitrite.

تم الكشف عن RSNO و RNNO باستخدام مقايسة نزع النيتروز الاختزالية. ومن خلال طرح مساحات القمم، تم قياس مستويات النتريت و r sno. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال أكسيد النيتريك والبيولوجيا الوعائية، مثل كيف تعكس المستويات المتداولة لهذه النواتج الأيضية لأكسيد النيتريك مستويات الأنسجة، وكيف تتغير النواتج الأيضية للمرض في حالات مرضية مختلفة؟

سيتيح تحديد تركيزات الحالة المستقرة وعمر النصف لنواتج أيض أكسيد النيتريك ذات الصلة في أنظمة أعضاء متعددة وعبر الدورة الدموية لحيوان واحد تحديد البصمات الجزيئية المحددة لعمليات المرض ومساعدتنا في تعريف أنماط علاجية جديدة قائمة على أكسيد النيتريك، مما سيزود الطبيب بمؤشرات حيوية أفضل لشدة المرض أو تطوره. وبشكل عام، سيواجه الأشخاص الجدد في مجال حمض النيتريك صعوبة لأن العديد من الطرق ليست حساسة بما يكفي للكشف عن هذه المستويات المنخفضة من نواتج أيض حمض النيتريك الموجودة في العينات البيولوجية وقياسها كمياً. أولاً وقبل كل شيء، من المرجح أن يتسبب غير المتمرسين في تكوين شوائب أثناء معالجة العينات، مما يؤدي إلى بيانات خاطئة وتفسير غير صحيح للبيانات.