الكمية التصوير من النسب المحددة اشارة مستقبلات بوساطة الرقم تشبه في وحيدات والخلايا الجذعية من عينات صغيرة من دم الإنسان

الهدف العام من التجربة التالية هو توضيح استخدام تقنية تدفق الصور (image stream technology) لكمية الآليات الخلوية للخلايا المناعية الأولية المستخلصة من مجموعات مرضى محددة بدقة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي أو pbmc من عينات دم تم الحصول عليها من المرضى أو متطوعين أصحاء. وبعد العزل، يتم تنشيط الخلايا ثم وسمها بفلورية.

بعد ذلك، يتم تركيز الخلايا هيدروديناميكيًا، وإثارتها بضوء الليزر وتصويرها باستخدام تقنية تكامل تأخير الوقت. كاميرا CCD. وأخيرًا، يتم الحصول على الصور باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي التصويري وتقدير كمية NF kappa b.

يتم إجراء عملية النقل في كل صورة خلوية باستخدام برنامج ideas. وفي النهاية، يمكن تحديد الاختلافات بين كل مجموعة من المجموعات الخاضعة للدراسة من خلال تحليل المخططات النقطية والمخططات التكرارية والصور الخلوية. وتكمن ميزة تدفق الصور في أنها تجمع بين الحقائق والفلورة المناعية.

نحن قادرون على دراسة مسارات نقل الإشارات الخلوية بطريقة محددة للسلالة، سواء على مستوى الخلية الواحدة أو المجتمع الخلوي، والبدء بعينة صغيرة فقط من الدم. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في المعرفة من خلال تحديد موقع وكمية الوسائط الناقلة للإشارات. على سبيل المثال، يمكن استخدامها لاستقصاء الانتقال النووي للعوامل الشفافة بوساطة فعل معين، أو لدراسة آثار الشيخوخة على البيولوجيا الخلوية.

سيقوم الباحث الأول من مختبري باستعراض التقنية بعد عزل الخلايا الليمفاوية أحادية النواة في الدم المحيطي التي تم الحصول عليها من متطوعين بشريين. أعد تعليق خلايا p BMCs المستخلصة بكثافة 3 × 10⁶ خلية لكل 0.6 مل من الوسط، ثم انقل معلق الخلايا إلى أنابيب سعة 1.5 مل. بعد ذلك، قم بتحفيز بعض الخلايا باستخدام عامل تنشيط مثل TLR8 LA R 8 4 8 الموضح هنا، ثم حضن جميع الخلايا عند 37 °C لمدة تتراوح بين 10 و60 دقيقة في حاضنة تحتوي على 5% CO2.

بعد فترة التحضين، يتم ترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 500 ×g في درجة حرارة الغرفة، ثم يتم التخلص من السائل الطافي، وتوسيم الخلايا باستخدام مزيج من الأجسام المضادة السطحية المحددة لسلالات الخلايا الوحيدة أو الخلايا التغصنية لمدة 20 دقيقة عند 4 °C، بما في ذلك أنابيب من الخلايا الموسومة بمرافقات ذات لون واحد لاستخدامها كعناصر تحكم في التعويض. بعد ذلك، يتم تثبيت الخلايا في 4% PFA-PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وبعد طرد الخلايا مركزياً لمدة 10 دقائق عند 500 ×g في درجة حرارة الغرفة، يتم إعادة تعليق pbmc في محلول التجميد وتخزين الخلايا عند -80 °C حتى يتم تحليلها في يوم المقايسة.

قم بإذابة الخلايا بسرعة في حمام مائي عند 37 degrees Celsius، ثم بعد إجراء عملية الطرد المركزي لإزالة محلول الحفظ من التجميد، قم بنفاذيتها باستخدام 100 microliters من BD perm wash buffer. بعد ذلك، قم بعملية الوسم باستخدام أجسام مضادة لمكونات الإشارات داخل الخلوية، مثل أجسام NF kappa BP 65 المضادة الموضحة هنا، لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد تجميع الخلايا في شكل رُسابة، أعد تعليقها في 100 microliters من BD perm wash buffer الذي يحتوي على goat anti rabbit IgG.

Alexa 6 47 ثم يتم تحضين الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (pbmc) لمدة 20 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة. وقبل التصوير مباشرةً، يتم صبغ الخلايا بصبغة نووية، والبدء بتشغيل جهاز ImageStream ثم تشغيل برنامج Inspire. بعد ذلك، انقر فوق "تحميل القالب الافتراضي" (load default template) ثم اختر "تهيئة نظام السوائل" (initialize fluidics).

ثم انقر على قائمة معرض الصور وحدد الكل. الآن اضغط على "run set up" لبدء تصوير الخرزات، ثم اختر قناة المجال المضيء (bright field channel). بمجرد أن تبدأ خرزات السرعة (speed beads) في التشغيل، انقر فوق "start all" ضمن علامة تبويب المساعدة (assist) لمعايرة الجهاز واختباره.

بعد معايرة نظام ImageStream، اضغط على flush, lock and load لتحميل العينة الأكثر سطوعاً في الجهاز. بعد ذلك، اضبط قدرة الليزر بحيث تكون القيمة القصوى للبكسل لكل flora chrome بين 104,000 counts كما تم قياسها في المخططات النقطية (dot plots). ثم قم بتحديد معايير تصنيف الخلايا.

انقر الآن على run، ثم acquire لجمع وحفظ ملف بيانات التجربة. لتحليل ملفات البيانات، افتح أولاً برنامج ideas. Analytical software لإنشاء ملفات صور معوضة، ثم قم بعمل gate للأحداث التي تظهر شدة صبغة نووية طبيعية ونسبة باعية عالية للصبغة النووية. وللتمييز بين الخلايا المفردة في الـ R one gate وبين الحطام أو الأحداث متعددة الخلايا، يتم العثور على الخلايا الوحيدة (monocytes) ضمن الـ gate للخلايا الموجبة لـ CD 14، بينما تكون الخلايا التغصنية النخاعية (myeloid dendritic cells)، التي تتميز بارتفاع CD 11 C وانخفاض CD four وعلامات lin one، في الـ R three gate.

أخيراً، استخدم برنامج ideas لتحديد التوضع المشترك لعامل النسخ السيتوبلازمي NF kappa B مع صبغة النواة. إن الارتباط العالي بين NF kappa B وصبغة النواة، والذي يشير إلى التوضع المشترك للمؤشرين، ينعكس في درجة تشابه عالية ويدل على درجة تنشيط الخلية. ويمكن مقارنة النسبة المئوية لأحداث التشابه العالي بين مجموعات العلاج المختلفة أو مجموعات المرضى لتقييم الكفاءة الوظيفية النسبية للخلايا باستخدام برنامج idea.

يمكن بعد ذلك استخدام البرمجيات لعرض صور الخلايا من الأجزاء الرئيسية لمخططات التوزيع التكراري للسكان. يتيح جهاز ImageStream تحديد البوابات لمجموعات فرعية من الخلايا مباشرة من pbmc وتصوير استجابات الخلايا من المجموعات الخلوية التي تم تحديد بواباتها ولكن لم يتم فرزها. وهنا تم قياس تأثير إشارات TLR على التموضع النووي لـ NF kappa BP 65 في lin one, negative CD four, dim CD 11 C positive myeloid dcs عند المستوى الأساسي.

لوحظ وجود نسبة عالية من الخلايا غير المحفزة التي يتواجد فيها عامل النسخ NF kappa BP 65 في السيتوبلازم. وبعد التحفيز، تحدد أن الخلايا المعالجة تمتلك درجة تشابه أعلى بكثير لـ NF Kappa BP 65 مع صبغة النواة PI، مما يشير إلى أن NF Kappa BP 65 قد انتقل إلى النواة بعد التحفيز. وتظهر الصور الرقمية التي تم جمعها بالتزامن للمجموعات الخلوية غير المعالجة والمحفزة بـ R 8 48 خلايا ممثلة وكثافة انتقال NF kappa B إلى نواة الخلية. لاحظ الكثافة الأكثر سطوعاً لصبغتي NF Kappa B و PI في المجموعة المحفزة بـ R 8 48 مقارنة بالخلايا غير المعالجة.

لقد استخدمنا هذه التقنية على خلايا من متبرعين بأعمار مختلفة، وأظهرنا اختلافات في مسارات تنشيط NF kappa B التي يتوسطها TLR. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون يوم واحد مع تخصيص وقت إضافي لتحليل الصور، مما يسمح بالحصول على عدة صور تحديد مواقع وإحصائيات سكانية خلوية في آن واحد. بالإضافة إلى ذلك، يمكننا تصوير الاستجابات مباشرة من مجموعات خلوية متعددة دون الحاجة إلى الفصل الفيزيائي. يمكن تطبيق تدفق الصور (Image stream) على نطاق واسع في عدد من الآليات الخلوية، ومن شأنه أن يكون ذا قيمة كبيرة في الأبحاث الانتقالية.