عزل الخلايا الظهارية الثديية من ثلاثي الأبعاد الخلايا المختلطة الجسم الشبه الكروي ثقافة المشارك

الهدف العام من هذا الإجراء هو اشتقاق الخلايا الظهارية من مزارع نسيجية خلوية مختلطة ثلاثية الأبعاد من أجل تحليل تأثيرات الخلايا الليفية السدوية على بيولوجيا الخلايا الظهارية. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال إنشاء مزارع مشتركة من الخلايا الستيرويدية المختلطة ثلاثية الأبعاد. ثم يتم فصل الكريات عن مزارع المصفوفة من أجل عزل الخلايا الظهارية بعد الزراعة المشتركة.

الخطوة التالية هي تمرير الخلايا الظهارية بعد الزراعة المشتركة حتى تصبح جاهزة للتحليل. في نهاية المطاف، يمكن تقييم آثار التعرض للخلايا الليفية في الزراعة ثلاثية الأبعاد على سلوك الخلايا الظهارية من خلال التصوير المجهري للمزارع وتحليل ما بعد الزراعة المشتركة. الخلايا الظهارية، مثل التصوير الفلوري لغزو المصفوفة والهجرة عبر Transwell كما هو موضح هنا، سيقوم كوين، وهو باحث مشارك من مختبري، باستعراض الإجراء الذي تم إنشاؤه في اليوم السابق لعمليات الزراعة المشتركة.

أخرج Matrigel من المجمد وأذب الثلج عنه على الجليد في ثلاجة بدرجة حرارة 4 °C طوال الليل. وفي يوم التجربة، ضع وسط المزرعة على الجليد لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل خلطه مع Matrigel. لتخفيف Matrigel المذاب.

أضف نصف حجم وسط H Mac المبرد بالثلج واللازم للزراعة المشتركة إلى أنبوب معقم موضوع على الثلج. ثم أضف إلى الأنبوب نفس نصف الحجم الإجمالي من الماتريجيل (matrigel) المذاب لتحقيق تخفيف بنسبة واحد إلى واحد، مع إبقاء الأنبوب على الثلج. بعد ذلك، ضع 50 µL من خليط وسط الماتريجيل في منتصف الآبار المحددة في طبق يحتوي على 24 بئرًا، ثم حضن الطبق في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C مع هواء مرطب و 5% CO2 لمدة 10 دقائق.

ثم أضف 450 microliters إضافية من خليط وسط matra gel إلى الآبار واحضنها لمدة 60 minutes أخرى. وأثناء فترة الحضن الثانية، قم بتحضير معلق بنسبة واحد إلى واحد من الخلايا الليفية والخلايا الظهارية بتركيز 0.5 × 10⁵ خلية في كل 0.5 milliliter من وسط H me. وعندما يتصلب خليط وسط matrigel، ضع معلق الخلايا برفق فوق الجل وأعد المزرعة إلى الحاضنة لمدة يومين.

قم بتغيير الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام عن طريق سحب الوسط برفق شديد من جانب البئر واستبداله برفق بوسط HEC جديد، وراقب تكون الكريات يومياً تحت المجهر مع التقاط الصور حسب الاقتضاء باستخدام المجهر الضوئي أو الفلوري. ابدأ بسحب المزرعة صعوداً وهبوطاً 10 مرات باستخدام ماصة زجاجية معقمة سعة 2 مل. ثم انقل المزرعة بالماصة الزجاجية إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل وقم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 350 ×g في درجة حرارة الغرفة؛ وبعد الطرد المركزي، ستترسب الكريات الخلوية في قاع الأنبوب.

استخدم طرف ماصة باستور معقمة لإزالة هلام ماترا الممزق برفق من أعلى جهاز الطرد المركزي. التحضير. أضف الآن 1 mL من وسط H mac إلى الراسب، ثم امزجه بسحبه للأعلى وللأسفل من مرتين إلى ثلاث مرات باستخدام ماصة زجاجية معقمة سعة 2 mL، ثم انقل المزرعة إلى بئر في طبق زراعة أنسجة يحتوي على 24 بئراً. اترك الستيرويد ليلتصق بالطبق لمدة 48 ساعة على الأقل قبل تغيير الوسط.

بمرور الوقت، ستغادر الخلايا البنية الكروية وتنمو كطبقات أحادية؛ وبعد وصول المزارع الخلوية إلى 50%Confluence، يتم نقلها باستخدام بروتوكول قياسي إلى طبق بقطر 35 مليمتر لمدة تتراوح من يومين إلى أربعة أيام، ثم تُنقل إلى طبق بقطر 100 مليمتر لمدة تتراوح من ثلاثة إلى خمسة أيام قبل إجراء المزيد من التحليلات على الخلايا. استخدم ماصة باستور معقمة لسحب الوسط، ثم قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الكريات المتبقية يدويًا. في المزارع المشتركة للكريات ثلاثية الأبعاد، تؤدي الخلايا الليفية ذات الإسكات الهندسي لـ TM one، كما هو موضح هنا في الأشكال d و E و F، إلى زيادة غزو المصفوفة بواسطة الخلايا الظهارية الثديية مقارنة بالخلايا الليفية الضابطة في الأشكال A و B و C. لاحظ البروزات الظهارية التي تغزو المصفوفة في الكريات التي تدمج الخلايا الليفية المسكتة لـ TM one، كما هو مشار إليه بالأسهم في الشكلين D و F. أما الخلايا الليفية ذات التعبير المفرط الهندسي لـ TM one الموضحة هنا في الأشكال JK و L، فقد أدت إلى تقليل غزو خط خلايا سرطان الثدي sum 1 59 مقارنة بالخلايا الليفية الضابطة في الأشكال GH و I؛ قارن بين غياب البروزات الظهارية في الكريات التي تدمج الخلايا الليفية المهندسة لـ TM one وتلك التي تدمج الخلايا الليفية الضابطة المشار إليها بالأسهم في الشكلين G و i بمجرد إنشاء الكريات في المزارع المشتركة.

يمكن عزل التجمعات الخلوية من الستيرويدات عن طريق إعادة الزرع في سياق ثنائي الأبعاد. تظهر هذه المجموعة المركبة من الصور المزارع تحت المجهر الضوئي والمجهر الفلوري بعد عزلها من مزرعة matrigel هنا. يمثل اليوم صفر التصوير مباشرة بعد العزل، بينما تشير الأيام واحد واثنين وخمسة إلى عدد الأيام التي تلت عملية العزل.

لاحظ كيف تزداد هالة الخلايا التي تغادر هذا الستيرويد بمرور الوقت. وفي النهاية، يتبقى ستيرويد شبحي يحتوي على عدد قليل جداً من الخلايا كما يشير السهم هنا. يبقى عدد قليل جداً من الستيرويدات بعد إزالة الأشباح وإجراء تمرير واحد.

بناءً على معدلات النمو النسبية للخلايا المختبرة. قد تظهر تجمعات خلوية نقية من خلال التمرير المتسلسل، أو يمكن فرزها باستخدام علامات خلوية مناسبة. يتم تحليل عينات الأنسجة في هذا المثال عن طريق قياس التدفق الخلوي، باستخدام الفلورة الخضراء والفلورة الحمراء لتحديد الخلايا الليفية التي تعبر عن GFP والخلايا الظهارية التي تعبر عن mCherry على التوالي، وذلك لتحديد التجمعات النسبية للخلايا الظهارية والخلايا الليفية.

بعد العزل من المزارع المشتركة ثلاثية الأبعاد (3D)، تحتفظ الخلايا الظهارية بالخصائص التي اكتسبتها من المزارع المشتركة مع الخلايا الليفية لفترات زمنية طويلة، مما يتيح فرصة كافية للتحليل. في هذا المثال، أدى التعرض لخلايا ليفية تعاني من نقص في TM one إلى زيادة الهجرة في خلايا H max التي تمت زراعتها بشكل مشترك، واستمر ذلك لأسابيع بعد العزل من المزرعة المشتركة ثلاثية الأبعاد مقارنة بالتعرض للخلايا الليفية الضابطة المرمزة هنا بـ C بعد اتباع هذا الإجراء. ويمكن إجراء طرق أخرى، مثل تلك المستخدمة لتحليل التغيرات في التعبير الجيني والعلامات فوق الجينية، للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بتأثيرات الخلايا الليفية على الخلايا الظهارية.