TransFLP - طريقة لتعديل وراثيا

الهدف من هذا الإجراء هو التلاعب الوراثي لـ vio cray باستخدام هذه الطريقة السريعة والفعالة، والتي تعتمد على التحول الطبيعي وتركيبة flip. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير مصدر مناسب للكيتين، حيث يُعد الكيتين المحفز الطبيعي للتحول. وفي الخطوة الثانية، يتم إنشاء بنية DNA باستخدام جولتين من PCR ويتم إجراء التحول الطبيعي، مما يسمح للبكتيريا التي تحتوي على البلازميد PBR flip بامتصاص قطعة PCR ودمجها في جينومها.

بعد ذلك، يتم استخدام رفع درجة الحرارة لتحفيز إنزيم الليباز المشفر بواسطة البلازميد لإزالة شريط مقاومة المضادات الحيوية المحاط بموقع استهداف إعادة التركيب flip أو موقع FRT. وفي الخطوة النهائية، يتم تخليص البكتيريا من البلازميد المشفر لـ FLP. وفي النهاية، يُستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والتسلسل الجيني لإثبات نجاح التلاعب الجيني.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل استخدام البلازميدات الانتحارية للتلاعب الجيني في الفيروسات، في أن هذه الطريقة سريعة وفعالة للغاية. ابدأ بوزن عينات تتراوح بين 50 إلى 80 milligram من رقائق الكيتين في أنابيب بلاستيكية قياسية سعة 1.5 milliliter، ثم مع تعريض الرقائق للتعقيم بالبخار (autoclave) مع ترك أغطية الأنابيب مفتوحة، وأغلق الأغطية فوراً بعد انتهاء عملية التعقيم وقم بتخزين مجموعة الرقائق المعقمة في درجة حرارة الغرفة. يلزم توفير ستة oligonucleotides على الأقل لتضخيم مناطق DNA المستهدفة، بالإضافة إلى كاسيت المضاد الحيوي المحاط بمواقع FRT عن طريق PCR. كما يُوصى بتضمين زوج من بادئات oligonucleotide خارج قطعة PCR المدرجة.

يتيح ذلك التحقق من الاندماج والاستئصال الصحيح لتصميم كاسيت مقاومة المضادات الحيوية المحاط بمواقع FRT، مع مراعاة تحضير قسيمات الحمض النووي (oligonucleotides) رقم اثنين وثلاثة وأربعة وخمسة بدقة. يجب أن يحتوي البادئان 2 و5 على 28 زوجاً قاعدياً على الأقل لتمكينهما من الارتباط الكافي بالحمض النووي الجينومي، بينما يجب بناء البادئين 3 و4 باستخدام بلازميد يحتوي على مواقع FRT كقالب؛ صمم البادئين 2 و5 للسماح بازدواج قاعدي تكميلي واسع عند الطرف '5 بين البادئين 2 و3، وبين البادئين 4 و5 على التوالي.

الآن، وبالنسبة للجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، استخدم قليلو النوكليوتيد (oligonucleotides) واحد واثنين لتحضير التفاعل الأول من بين ثلاثة تفاعلات PCR متزامنة ولكن مستقلة، وذلك لتضخيم المنطقة العلوية (upstream region) من المنطقة التجريبية ذات الأهمية في البنى المصممة خصيصاً. وبالتوازي، قم بتحضير تفاعل PCR الثاني باستخدام قليلو النوكليوتيد ثلاثة وأربعة لتضخيم كاسيت المضاد الحيوي المحاط بتسلسلات FRT. على سبيل المثال، في هذه التجربة، تم استخدام جين A PH الذي يشفر لمقاومة الكاناميسين.

قم بتضخيم منطقة DNA المصب بالتزامن من خلال تحضير تفاعل PCR الثالث باستخدام قليلات النوكليوتيد الخامسة والسادسة وDNA الجينومي كقالب. بعد ذلك، ابدأ تفاعل PCR لجميع العينات الثلاث، وبعد تنقية جميع شظايا PCR الثلاث، استخدم خليطاً بكميات متساوية من جميع الشظايا الثلاث التي تم الحصول عليها في الجولة الأولى كقالب لإجراء جولة ثانية من PCR. سيتم تحفيز هذا التضخيم بواسطة قليلات النوكليوتيد الأولى والسادسة.

ستعمل قطعة PCR الناتجة كحمض DNA مُحوِّل في تجارب التحول الطبيعي. بعد تنمية خلايا v cholera في وسط غني هوائي عند 30 درجة Celsius، يتم حصاد البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، انقُل المزرعة البكتيرية إلى رقائق الكيتين واحضن معلق الخلايا طوال الليل عند 30 degrees Celsius. ثم، اخلط بعناية ما لا يقل عن 200 nanograms من الشظايا المشتقة من تفاعل PCR للدورة الثانية في معلق الخلايا البكتيرية. مع مراعاة عدم فصل البكتيريا بشكل كبير عن أسطح الكيتين، احضن هذا المحلول عند 30 degrees Celsius دون تحريك ليوم آخر.

الآن، قم برجّ المزرعة بقوة باستخدام جهاز الـ vortex لمدة 30 ثانية على الأقل؛ وبالنسبة للبكتيريا التي تحمل بلازميد PBR flip، قم بنشر 100 إلى 300 µL من محلول الخلايا على أطباق اختيار مزدوجة تحتوي على الأمبيسيلين، بالإضافة إلى المضاد الحيوي الآخر الموجود في الأطباق. قم بتحضين مزارع الخلايا البكتيرية عند 30 °C حتى تظهر المستعمرات. بعد ذلك، قم بعزل المحولات الفردية من أطباق الاختيار.

ابدأ هذه الخطوة بنمذجة البكتيريا على أطباق آجار LB التي تحتوي على الأمبيسيلين عند درجة حرارة 37 °C لمدة تتراوح من 16 إلى 24 ساعة. كخطوة اختيارية، قم بتغيير درجة الحرارة لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات إلى 40 °C، حيث يتم إلغاء كبح تعبير flip من بلازميد PBR flip عند درجات الحرارة المرتفعة. بعد ثماني ساعات إضافية من الحضن عند 37 °C، انقل البكتيريا إلى أطباق جديدة.

الآن، قم بتقييد المستنسخات بالتوازي على أطباق آغار تحتوي على مضادات حيوية وأخرى خالية منها لاختبار الحساسية للمضادات الحيوية، ثم اعزل مستعمرة واحدة ناتجة تكون حساسة للمضاد الحيوي. ابدأ هذه الخطوة بتنمية المزرعة طوال الليل تحت ظروف هوائية عند 30 درجة مئوية في وسط إغناء خالٍ من المضادات الحيوية. في صباح اليوم التالي، قم بتنمية مزرعة جديدة لمدة تتراوح من ثلاث إلى ست ساعات عن طريق تخفيف مزرعة الليل بنسبة 1 إلى 100 في وسط جديد خالٍ من المضادات الحيوية، وفي فترة ما بعد الظهيرة، قم بتخطيط أو صب تخفيف المزرعة على أطباق آغار LB عادية، ثم حضن الأطباق لمدة تتراوح من 8 إلى 16 ساعة أخرى عند 30 درجة مئوية حتى تصبح المستعمرات مرئية.

في هذه التجربة الأولى التي تهدف إلى حذف الجينات المجاورة CTXA وCTXB. تم توليد قليلات النوكليوتيد لطريقة trans flip، وكما تم توضيحه، فقد تم اختبار السلالة الأبوية، والسلالة الوسيطة التي تحمل كاسيت المقاومة للمضادات الحيوية المحاط بـ FRT بدلاً من الموضع الأصلي للحمض النووي C-T-X-A-B، والسلالة النهائية التي تم فيها حذف C-T-X-A-B وتحررت من كاسيت المقاومة، وذلك للتحقق من أنماطها الجينية. وقد أُجري تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) الشامل لهذه التجربة باستخدام بادئات لا ترتبط بقطعة PCR التحويلية، بل ترتبط فقط بالحمض النووي الكروموسومي. ثم فُصلت قطع PCR عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام القياسي لتحديد أحجامها.

في المسار الأول، تم تحديد سلالة كوليرا العالم من النوع B عند حجم القطعة المتوقع وهو 3, 143 base pairs. وفي المسار الثاني، تم تحديد قطعة PCR المشتقة من السلالة delta C-T-X-A-B-F-R-T can. FRT عند 3, 162 base pairs.

وفي المسار الثالث، تم تحديد موقع قطعة delta ctx A B FFR TP CR عند 1,769 زوجاً قاعدياً مقارنةً بسلم 1 KB. وفي المثال الثاني الذي تمت فيه إزالة جزيرة جينومية كاملة، تم اختيار جزيرة ضراوة فيبريو الأولى أو VPI one كهدف لهذه التجربة. وقد عُدلت طريقة trans flip في خطوتين.

أولاً، تمت عملية دمج جين مقاومة الكاناميسين (kanamycin) مسبوقة بموقع FRT واحد في بداية الجزيرة الممرضة (PI) الأولى. بعد ذلك، أُجريت جولة ثانية من التحول الطبيعي، مما سمح بإدراج علامة مقاومة مضاد حيوي إضافية، وهي مقاومة الجنتاميسين (Gentamycin)، تليها موقع FRT ثانٍ في نهاية الجزيرة الممرضة. وقد أشير إلى أزواج البادئات المقابلة فوق كل صورة للهلام (gel)، واستمرت طريقة trans FLP كما تم توضيحها للتو.

تم التحقق من السلالات الأبوية والوسيطة والنهائية جميعاً عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للحمض النووي الجينومي المنقى في المسار الأول. وتم تشغيل قطعة PCR لسلالة V cholera البرية في المسار الثاني. كما تم تشغيل قطعة PCR الناتجة عن السلالة VPI one FRT can GM FRT.

وفي المسار الثالث، تم تحليل ناتج PCR المشتق من السلالة delta VPI one FRT. وتظهر أزواج البادئات فوق كل صورة للهلام. تفتقر السلالة النهائية إلى VPI one بالكامل.

في هذا المثال الثالث، تم دمج تسلسل محفز معتمد على RNA polymerase T7 في الجزء العلوي من جين T fox، وهو منظم رئيسي للتحول الطبيعي، باستخدام طريقة trans flip مع تعديل طفيف عن البروتوكول القياسي. تضمن تسلسل الإجماع للمحفز المعتمد على RNA T7 بروزات في قليلات النوكليوتيد رقم أربعة ورقم خمسة، وذلك لضمان الحفاظ على تسلسل DNA هذا داخل الكروموسوم. وحتى بعد استئصال كاسيت مقاومة المضادات الحيوية، تم دمج البناء بعد ذلك في سلالة V colorized تحتوي على RNA polymerase T7.

في هذه السلالة، تم توجيه التعبير عن جين T7 RNA polymerase بواسطة محفز LAC UV5 لاختبار التعبير عن T Fox المعتمد على T7 RNA polymerase. أُجريت اختبارات التحول الطبيعي في وسط LB. السلالة الأبوية التي تفتقر إلى المحفز المعتمد على T7 الذي يسبق جين T Fox غير قابلة للتحول الطبيعي تحت هذه الظروف نظرًا لغياب نسخ T FOX في الوسط الغني وفي غياب محفزه الطبيعي الكيتين. كان هذا النمط الظاهري مستقلاً عما إذا تم تحفيز T7 RNA polymerase اصطناعياً بواسطة IPTG أم لا.

ومع ذلك، فإن سلالة trans flip الناتجة، والتي تحتوي على محفز معتمد على T7 RNA polymerase يقع في الجهة العلوية من جين الكفاءة T Fox، كانت بالفعل قابلة للتحول الطبيعي في الوسط الغني نتيجة لتسرب محفز LAC UV five في وسط LB. حيث قام T7 RNA polymerase الناتج بنسخ T FOX من المحفز المعتمد على T7 RNA polymerase دون الحاجة إلى التحفيز بواسطة IPTG. وقد أدى ذلك إلى بدء الكفاءة الطبيعية والتحول، مما أكد فاعلية تسلسل المحفز المعتمد على T7 RNA polymerase المدمج.

تم تعزيز هذا النمط الظاهري بشكل ملحوظ من خلال الحث الكامل لإنزيم T7 RNA polymerase نتيجة إضافة IPTG، وهو محفز المروج LAC UV5. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التلاعب الجيني ببكتيريا V. cholerae باستخدام مزيج من التحول الطبيعي المحفز بالشيتوزان وإعادة التركيب بطريقة flip. وبمجرد إتقان هذه التقنية، ستتمكن من حذف الجينات أو الجزر الجينومية، بالإضافة إلى دمج تسلسلات DNA بطريقة موجهة للموقع في غضون أيام قليلة فقط.