المشعة في الموقع التهجين، لتحديد متنوعة أنماط التعبير الجيني في الأنسجة

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد مناطق تعبير جيني معينة وتوصيف توقيت ومستويات هذا التعبير الجيني للمساهمة في فهم وظيفة الجينات. ويتم تحقيق ذلك من خلال الحصاد السريع للأنسجة المراد استخدامها في الإجراء وتحضيرها للحفاظ على سلامة النسيج. وكخطوة ثانية، تُعالج الأنسجة لتقليل الارتباط الخلفي للمجسات الريبوزومية (ribo probes).

بعد ذلك، يتم تهجين المسابر الريبوزومية (ribo probes) مع النسيج، ثم يتم تصور ارتباط مسبار RIBA. ويتم الحصول على النتائج باستخدام فيلم الأشعة السينية أو المستحلب الحساس للضوء، والتي توضح موقع ومستوى التعبير الجيني بناءً على صور الأشعة السينية أو تحليل مجهر الحقل المظلم والحقل المضيء. وباستخدام برنامج Image J، هناك عدة خطوات حاسمة يجب تنفيذها بدقة حيث يرتكب الكثيرون أخطاءً فيها، ومن أهمها منع ظهور الخلفية (background).

هناك عدد من الخطوات التي قد تتسبب في ظهور خلفية، مثل التشبع الضعيف أو عدم إجراء التهجين في درجة الحرارة المناسبة. وثمة سبب آخر هو التلوث بـ RNA الذي سيؤدي إلى تحلل مسبار RNA الخاص بك. لذا، يجب توخي الحذر لضمان خلو جميع المستلزمات من الـ RNAs.

والثالث هو أنه عند غمس الشرائح في المستحلب، يجب التأكد من عدم وجود أي تسربات ضوئية في الغرفة المظلمة أو تعرض المستحلب للضوء خلال جميع مراحل تلك العملية، والتي قد تستغرق ثلاثة أسابيع. لذا، سيقوم Hun Chen، وهو باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري، بتوضيح هذه التقنية. بعد استئصال دماغ حديث وريّه بـ 1× PBS، يتم تضمين الدماغ في وسط OCT tissue tech عن طريق غمر الدماغ في قالب يحتوي على الوسط في درجة حرارة الغرفة.

تأكد من توجيه الدماغ بالشكل المطلوب للتقطيع. بعد ذلك، قم برش الثلج الجاف بالإيثانول، ثم جمد النسيج بوضع الكتلة في خليط الإيثانول والثلج الجاف. وباستخدام جهاز الميكروتوم المجمد (cryostat)، مع الحرص على عدم وصول الإيثانول إلى داخل الكتلة، قم بتقطيع النسيج المجمد إلى شرائح يتراوح سمكها من 10 إلى 12 ميكرون، ثم ثبتها على شرائح super plus المخصصة لأنسجة الدماغ والأنسجة الجنينية.

تتراوح درجة حرارة القطع المثلى بين -18 °C و -20 °C. تُخزن المقاطع في صندوق شرائح عند درجة حرارة -80 °C. تُنقل الشرائح من وحدة التخزين عند -80 °C إلى رف معدني على الثلج الجاف.

بعد ذلك، وأثناء العمل داخل خزانة استخلاص غازات معتمدة، ضع الحامل في محلول 4% para formaldehyde تم تدفئته مسبقاً ليكون أعلى من درجة حرارة الغرفة بمقدار ثلاث إلى خمس درجات Celsius. اترك العينات في الحاضنة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وبعد انتهاء فترة التحضين، أخرج الحامل من محلول para formaldehyde واغسل الشرائح عن طريق غمس الحامل في PBS لـ 15 مرة. كرر خطوة الغسيل هذه مرتين مع استخدام محلول PBS جديد في كل مرة.

بعد ذلك، اغمر الشرائح في محلول منظم للأستلة (acetylation buffer) مُحضّر حديثاً لمدة 10 دقائق لتقليل الارتباط غير النوعي لمسبار RIBA. ثم اغسل الشرائح كما سبق، ولكن استخدم هذه المرة محلول SSPE بتركيز ضعفين كمحلول غسيل. قم بتجفيف الأنسجة من الماء من خلال سلسلة من الإيثانول بتركيزات 70% و95% و100% لمدة دقيقتين في كل محلول.

ثم جفف الشرائح في خزانة استخلاص الغازات لمدة لا تقل عن 10 إلى 15 دقيقة. بعد تخليق مسبار RIBA، ووفقاً للتعليمات الواردة في البروتوكول المكتوب، احسب الحجم المطلوب من مسبار RIBA ومحلول التهجين اللازم لجميع الشرائح. قم بتدفئة خليط تهجين مسبار Ribo مسبقاً عند 65 °C لمدة خمس دقائق.

لمسخ مسبار Ribo، اسحب 100 µL من محلول تهجين مسبار Ribo ووزعه على طول شريحة التغطية. ثم استخدم شريحة تغطية زجاجية ثانية لنشر المحلول بالتساوي فوق النسيج وشريحة التغطية. ضع الشريحة بشكل أفقي ووجهها للأعلى في حامل معدني، وبمجرد تجهيز جميع الشرائح، اغمر الحامل ببطء في حمام زيتي بدرجة حرارة 65 °C لمدة لا تقل عن أربع ساعات وبحد أقصى 16 ساعة.

يعمل الزيت على تكوين سدادة محكمة الغلق حول غطاء الشرائح بعد فترة الحضانة؛ لذا يجب إزالة أي زيت زائد من الرف المعدني الذي يحتوي على الشرائح. ثم يوضع الرف في حوض زجاجي أو معدني يحتوي على الكلوروفورم داخل خزانة استرداد الغازات. تكرر عملية الغسل باستخدام حوض ثانٍ يحتوي على كلوروفورم جديد.

بعد ذلك، اغمر الرف في محلول 0.1%beta-mercaptoethanol مضافاً إليه محلول SSPE بتركيز 2× لخلخلة شرائح الغطاء وإذابة محلول التهجين الزائد. ثم انقل الشرائح إلى محلول ثانٍ من 0.1%beta-mercaptoethanol في محلول SSPE بتركيز 2×. انقل الشرائح التي أزيلت أغطيتها إلى رف جديد في صينية تحتوي على 0.1%beta-mercaptoethanol في محلول SSPE بتركيز 2×، واتركها في هذا المحلول لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لإزالة مسبار RNA غير المرتبط الزائد.

ثم انقل حامل الشرائح إلى محلول SSPE بتركيز 2× مضافاً إليه 50% من محلول main wide، تم تسخينه مسبقاً إلى 65 درجة مئوية ويحتوي على beta ME و ethanol بتركيز نهائي 0.1%، واتركه في الحاضنة عند 65 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد انتهاء فترة التحضين، تخلص من هذا المحلول وجميع محاليل الغسيل المائية السابقة بالإضافة إلى أغطية الشرائح باعتبارها نفايات مشعة. بعد ذلك، اغسل الشرائح مرتين في محلول SSPE بتركيز 0.1× مسخن مسبقاً عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في كل مرة.

بعد ذلك، يتم تجفيف الأنسجة عبر سلسلة من الإيثانول بتركيزات 70% و95% و100% لمدة دقيقتين في كل محلول. وأخيراً، تُجفف الشرائح في خزانة استخلاص الغازات لمدة 30 دقيقة على الأقل. وذلك أولاً لتحديد ما إذا كانت هناك إشارة إشعاعية موجودة في الأنسجة.

ضع الشرائح المجففة في كاسيت تصوير، مع العمل في غرفة مظلمة باستخدام ضوء آمن، ثم ضع فيلم الأشعة السينية فوق الشرائح. تأكد من أن الشرائح مواجهة لجانب المستحلب في الفيلم ثم أغلق الكاسيت. عرض الشرائح للفيلم لمدة تتراوح من يوم واحد إلى سبعة أيام، وذلك اعتماداً على الوفرة المتوقعة للنُسخ.

بعد اكتمال عملية التعريض، يتم تحميض فيلم الأشعة السينية في المظهر والمثبت القياسيين. ستظهر إشارة التهجين كمناطق سوداء على الفيلم ناتجة عن حبيبات الفضة المعرضة في المستحلب لتحديد الدقة الخلوية ورؤية الإشارة على النسيج نفسه. تُغمس الشرائح في مستحلب فوتوغرافي ثم تُصبغ بصبغة مضادة.

إذا كان سيتم صبغ الشرائح بصبغة كريستال فيوليت كصبغة مضادة، فيجب حينئذٍ إزالة البارافين من المقاطع وفقاً للتعليمات الواردة في البروتوكول المكتوب. في هذه المرحلة، وأثناء العمل في الغرفة المظلمة، اسكب الماء المقطر في أنبوب. استخرج مستحلب NTB وقم بتخفيف المستحلب بالماء المقطر بنسبة واحد إلى واحد.

بعد إذابة المستحلب في حمام مائي عند 42 °C لمدة تتراوح من 20 إلى 30 دقيقة، انقله إلى وعاء غمس زجاجي في حمام مائي عند 42 °C لمدة تتراوح من 20 إلى 30 دقيقة. يجب أن يغطي مستوى المستحلب المخفف الآن جميع المقاطع الموجودة على الشريحة عند غمس الشريحة فيه. في حال وجود عدد كبير من الشرائح، قد تكون هناك حاجة إلى كمية إضافية من المستحلب.

الآن اغمس الشرائح في المستحلب المخفف في حمام مائي عند درجة حرارة 42 °C، ثم جفف الشرائح المغموسة في حاوية مغلقة ومحكمة الإغلاق ضد الضوء طوال الليل في الغرفة المظلمة، أو في فرن عند درجة حرارة 37 °C لمدة تتراوح من ساعتين إلى ثلاث ساعات مع إطفاء الأنوار. بعد التجفيف، انقل الشرائح إلى صندوق شرائح. قم بإغلاق الحواف باستخدام شريط لاصق كهربائي أسود ثم غطِّ الصندوق بورق الألومنيوم.

تُحفظ الصناديق عند درجة حرارة 4 °C لعدة أيام أو أسابيع، وعندما يحين وقت التحميض، يتم تدفئة الشرائح حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، وأثناء العمل في الغرفة المظلمة، يتم إخراج الحامل الذي يحتوي على الشرائح من الصناديق وتحميضها باستخدام محلول التحميض codec D 19 عند درجة حرارة 16 °C لمدة تتراوح من 3 إلى 5 دقائق. ثم تُغسل الشرائح المحمضة بماء الصنبور في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.

ثم يتم تحضين الشرائح مرتين في محلول التثبيت عند 19 درجة Celsius لمدة ست دقائق في كل مرة، ويمكن تشغيل أضواء الغرفة أثناء عملية التحضين الثانية في المثبت. الآن، تُغسل الشرائح تحت الماء الجاري في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل. بعد ذلك، وباستخدام شفرة حلاقة، يتم كشط المستحلب من ظهر الشريحة بينما لا تزال رطبة.

أخيرًا، قم بالصبغة المضادة باستخدام crystal violet بتركيز 0.3%، ثم قم بتجفيف الشرائح وتثبيتها وفقًا للتعليمات الواردة في البروتوكول المكتوب إذا لزم الأمر. قم بعد ذلك بتنظيف أي مستحلب زائد على ظهر الشرائح عن طريق ترطيبها بالماء وكشطها باستخدام شفرة حلاقة. اشطف الشرائح في محلول ethanol بتركيز 80% وامسحها بلطف من مرة إلى مرتين للتخلص من الشوائب والغبار.

التقط الصور تحت إضاءة المجال المظلم (darkfield) أو المجال المضيء (brightfield). قد يتطلب الأمر تكرار خطوات الكشط والتنظيف من مرتين إلى ثلاث مرات للحصول على صور جيدة خالية من جزيئات الغبار، والتي يمكن رؤيتها بسهولة في المجال المظلم باستخدام مجهر تشريحي. الصور التالية هي أمثلة على التصوير الشعاعي الذاتي لعملية التهجين الموضعي (in situ hybridization) مأخوذة من أفلام الأشعة السينية.

تظهر صورة فيلم الأشعة السينية هذه مقطعاً سهمياً كاملاً لرأس طائر الزيبرا Finch في اليوم الجنيني 10، والذي تم تهجينه بمسبار ريبو مضاد للمعنى لـ Fox P one. تشير الحبيبات السوداء الظاهرة على الفيلم إلى تعبير messenger, RNA كما يمكن رؤيته داخل الدماغ؛ حيث يتركز Fox P one messenger, RNA هنا في meso alium stri aum والمهاد الظهري. وتظهر صورة فيلم الأشعة السينية مقطعاً من نفس طائر الزيبرا finch الذي تم تهجينه بمسبار 90 cents RIBA لـ Cuper.

يتم تركيز TF two في النواة المجاورة للمنصف وأجزاء أخرى من المهاد البطني. الصور التالية هي أمثلة للتصوير الشعاعي الذاتي للتهجين الموضعي من شرائح مغموسة في المستحلب. تُظهر هذه الصورة بالمجال المظلم، والتي التُقطت باستخدام مجهر تشريحي، مقطعاً سهمياً للرأس كاملاً لطائر zebra finch في اليوم السادس بعد الفقس، حيث تم تهجينه بمسبار RIBA مضاد للمعنى لـ Fox P one.

تُظهر حبيبات الفضة البيضاء المكشوفة في المستحلب فوق النسيج تعبير RNA المرسال. ويمثل اللون الأحمر صبغة كريسيل فيوليت. ويمثل شريط القياس واحد مليمتر.

تظهر الصورة هنا مقطعاً من نفس طائر الزيبرا (zebra finch) الذي تم تهجينه بمسبار ribo مضاد للمعنى لـ coop TF two. وتقارن الصور التالية بين الوسم المضاد للمعنى والوسم المتوافق في المعنى، مما يظهر أنماطاً مختلفة موضحة عبر التصوير الشعاعي الذاتي على أفلام الأشعة السينية لشرائح من رأس جنين طائر الزيبرا في اليوم الجنيني 12. يشير الخط المتقطع إلى محيط الدماغ بأكمله، بينما تشير العلامة C إلى المخيخ.

يمكن ملاحظة أن الشريط المضاد للمعنى لـ PAC six يُعبر عنه في الدماغ وبشكل خاص في المنطقة البطينية. ويكشف المقطع المجاور الذي تمت تهجينه مع شريط المعنى لـ pack six عن عدم وجود تعبير خلفي في جميع أنحاء رأس الجنين، ولكن يظهر تعبير واضح في طبقة الصبغة بالشبكية كما هو الحال في الشريط المضاد للمعنى. تظهر الصور التالية في C إشارتين للتعبير الجيني وشرائح مغموسة في المستحلب مأخوذة من دماغ طائر zebra finch خلال المراحل الجنينية المتأخرة تحت رؤيتي المجال المضيء والمجال المظلم.

تظهر هذه الصورة المجهرية بالمجال المضيء تعبير D one B في اليوم الجنيني 10. ونظراً للتعرض الطبيعي للمستحلب، فإن العلامة التي تظهر باللون الأسود تكاد تكون غير مرئية عند هذا التكبير. تعرض هذه الصورة مقطعاً وتكبيراً متطابقين مع ما ظهر في الصورة السابقة، ولكن مع الانتقال إلى عرض المجال المظلم الذي يظهر العلامات باللون الأبيض في الجسم المخطط والمهاد.

تظهر هذه الصورة بالمجهر ذو المجال المضيء تعبير الشق الثالث في اليوم الجنيني 12. بعد التعرض المفرط للمستحلب، يمكن رؤية العلامة السوداء بوضوح. تشير SC إلى موقع الحبل الشوكي، بينما تشير CB إلى موقع المخيخ.

الجهة المنقارية موجهة نحو اليسار. الصورة المعروضة هنا هي لنفس المقطع وبنفس التكبير، ولكن تم تحويلها إلى عرض المجال المظلم الذي يظهر الوسم باللون الأبيض في الحبل الشوكي بما يتطابق مع صورة المجال المضيء. تُظهر الصور التالية دقة حبيبات الفضة على المستوى الخلوي.

يظهر هنا وسم الحمض النووي الريبوزي المرسال Fox P one في الدماغ الأمامي لطائر الزمير، حيث تظهر حبيبات الفضة كبقع سوداء فوق الخلايا المصبوغة بالبنفسج البلوري. وتوضح هذه الصورة تعبيراً عالي الوفرة عبر الخلايا الفردية في المنطقة الوسطى من القشرة المخية (meso alium) لطائر الزمير البالغ. بينما توضح هذه الصورة تعبيراً منخفض الوفرة عبر الخلايا الفردية في القشرة المخية (alium) المجاورة في المقطع نفسه هنا.

يظهر تعبير mRNA لـ Hi Fox. P one messenger في خلايا الـ meso alium في اليوم الجنيني 12.

تظهر الخلايا الجنينية هنا بحجم أصغر وتكدس أكثر كثافة مقارنة بالخلايا البالغة التي ظهرت في الصورتين السابقتين. وأخيراً، توضح هذه الصورة تعبيراً منخفض الوفرة عبر الخلايا في الغلالة المحيطة المجاورة من المقطع نفسه. بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل الكيمياء النسيجية المناعية للإجابة على أسئلة إضافية، مثل تحديد نوع الخلايا التي يتم التعبير عن الجين المستهدف فيها.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية إجراء عملية التهجين المؤسسي. لا تنسَ أن العمل مع الكواشف المشعة يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا يجب اتخاذ الاحتياطات دائماً، مثل استخدام وسائل الحماية الشخصية، أثناء هذا الإجراء.