عزل Oligomers بي ار بي القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان في دماغ الإنسان العادي

الهدف من هذا الإجراء هو عزل البروتين الشبكي القابل للذوبان وغير القابل للذوبان أو PRP من جميع الأربطة في الدماغ البشري الطبيعي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تجنيس أنسجة الدماغ البشري وعزل الأجزاء. بعد ذلك، يتم إجراء الترسيب بالسرعة في تدرجات السكروز المتدرجة.

بعد ذلك، يتم إجراء كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي. وأخيراً، يتم التقاط PRP باستخدام البروتين G5P. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر عزل PRP الذائب وغير الذائب أو الترسبات من الدماغ البشري الطبيعي من خلال الطرد المركزي الفائق في تدرجات السكروز المتدرجة، وكروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي، والتقاط PRP بواسطة G5P. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في أبحاث أمراض البريون، بما في ذلك مرض كروتزفيلد جاكوب، واعتلال الدماغ الموتشي البقري، وأمراض الهزال السريرية. كما يمكنها تقديم رؤى حول عزل البروتينات الذائبة وغير الذائبة، ليس فقط لأمراض البريون، بل أيضاً لأمراض أخرى مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون.

بشكل عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في هذه الطرق صعوبة لأن جميع الخطوات التجريبية مهمة وتتطلب عناية إضافية. ويعد العرض المرئي لهذه الخطوات أمراً بالغ الأهمية، حيث إن عملية SEC Fi تتسم بالدقة والعمق، كما أن عملية التقاط PRP باستخدام G five P صعبة التوصيف وقد لا تكون دقيقة دون تشغيل أكثر إحكاماً. لتحضير متجانس الدماغ، ابدأ بإضافة 100 µL من محلول التحلل (lysis buffer) إلى 100 mg من أنسجة الدماغ المجمدة، وباستخدام مدقة آلية، قم بتجنيس الأنسجة على الثلج، ثم جمدها على الثلج الجاف لمدة خمس دقائق وأعد تجنيسها مرة أخرى.

قم بتحضير متجانس كلي للدماغ بتركيز 20% أو 10% عن طريق إضافة 300 أو 800 µL على التوالي من محلول التحلل (lysis buffer). وباستخدام جهاز طرد مركزي مكتبي، قم بدوران المتجانس عند 1000 G لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C. اجمع الـ SNA في جهاز طرد مركزي مزود بدوار S SW 55 وقم بتدوير الجزء S1 عند 35,000 RPM لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 4 °C.

انقل الرائق إلى أنبوب نظيف. قم بإعادة تعليق الراسب غير القابل للذوبان في المنظفات في محلول التحلل لتحضير العينات لتقنية western blot. قم بحضن كسري S two و P two مع 50 micrograms per milliliter من proteinase K لمدة ساعة واحدة عند 37 degrees Celsius.

أوقف عملية الهضم بإضافة 5 mM من PMSF ومحلول SDS العازل للعينات. اغلي العينات لمدة 10 دقائق ثم اتركها لتبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ولإجراء عملية الترسيب بالسرعة، ابدأ بتحضين 450 µL من كسر S one بتركيز 20% مع حجم مساوٍ من Sarco X بتركيز 2% في الماء على الثلج لمدة 30 دقيقة في أنابيب طرد مركزي سعة 5 mL. أضف 0.5 mL من كل من السكروز بتركيزات 60 و30 و25 و20 و15 و10%. حمّل 0.4 mL من S one المحضن فوق طبقة السكروز بتركيز 10 إلى 60%.

قم بإجراء عملية طرد مركزي للتدرجات الخطوية في دوّارة SW 55 بسرعة 48,000 RPM لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية بدءاً من أعلى الأنبوب. اجمع 12 جزءاً متساوياً بحجم 283 µL لكل منها. استخدم 20 µL من كل جزء مع حجم مساوٍ من منظم عينات SDS.

لتحضير عينات هلام SDS page. يتم غلي العينات لمدة 10 دقائق، ثم تبريدها لمدة أربع دقائق. بعد ذلك، تُطرد العينات مركزياً عند 1000 G لمدة دقيقة واحدة.

ثم قم برجّها باستخدام جهاز المزيج الدوامي قبل تحميلها على هلام صب مسبق لفصل الحجم. يُستخدم كروماتوغرافيا استبعاد الحجم لتحديد الحالة الأوليغوميرية لجزيئات PRP. ابدأ بتحميل أحجام عينات قدرها 200 microliter من سبعة مؤشرات كتلة جزيئية فردية على عمود مقاس 1 × 30 من حبيبات SUEx 200 HR.

استخدم حجم شطف blue dextran كحجم الفراغ. احسب أحجام شطف القمة لـ VE من الكروماتوجرام والاحتجازات الجزئية. احسب معامل التوزيع KAV باستخدام المعادلة KAV يساوي V ناقص V zero مقسومة على VT ناقص V zero.

لإنشاء منحنى معايرة، يتم رسم KAV لمعايير البروتين مقابل لوغاريتم الوزن الجزيئي للمعاير. بعد ذلك، يتم وضع 200 µL من S one في العمود بمعدل تدفق قدره 0.25 mL/min.

اغسل العمود باستخدام محلول التحلل lysis buffer 1%cile، واستخدم مجمّع أجزاء لاستخلاص أجزاء بحجم 0.25 milliliter. قم بحضن 125 µL من كل جزء مع 500 µL من الميثانول المبرد مسبقاً عند درجة حرارة -20 °C لمدة ساعتين. ثم قم بطرد العينات مركزياً عند 13,000 ×g لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C.

أعد تعليق الراسب في 20 µL من منظم عينات SDS، ثم قم بغليه لمدة 10 دقائق. اترك العينات لتبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة، ثم قم بفصلها باستخدام هلامات بولي أكريلاميد بتركيز 15%. استخدم المنحنى القياسي لاستنتاج الأوزان الجزيئية لمختلف أنواع PRP المستردة لربط جزيء G five P بالخرز المغناطيسي.

يتم تحضين 100 µg من G five P مع 350 µL من toci activated magnetic beads في 1 mL من PBS عند درجة حرارة 37 °C لمدة 20 ساعة. استخدم مغناطيسًا خارجيًا لجذب حبيبات G five P إلى الجدار الجانبي لأنابيب eppendorf، ثم قم بإزالة المحلول. اغسل الحبيبات ثلاث مرات باستخدام 1 mL من PBS 0.1%BSA لمنع الارتباط غير النوعي.

قم بتحضين حبيبات G5P المقترنة في 1 مل من 0.2 molo tris, HCL pH 7.4 يحتوي على 0.1%BSA لمدة خمس ساعات عند 37 °C. بعد ذلك، اغسل الحبيبات ثلاث مرات. قم بإزالة الغسلة الأخيرة وأضف 1 مل من PBS لعزل PRP، ثم قم بتحضين 100 µL من S1 أو P2 مع 60 µL من حبيبات G5B المقترنة في 1 مل من محلول الربط (binding buffer) تحت تدوير مستمر لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة.

ضع الأنبوب على المغناطيس. قم بإزالة المحلول واغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام محلول الغسل المنظم (wash buffer). أزل غسلة المرة الأخيرة وأضف محلول SDS لعينة العينة (SDS sample buffer).

سخن الخرز عند 95 °C لمدة خمس دقائق. حمّل العينات على هلامات precast بنسبة 15% وقم بتشغيلها عند 150 فولت لمدة 80 دقيقة تقريبًا. انقل البروتينات إلى غشاء PVDF عند 70 فولت لمدة ساعتين بعد غلق الأغشية (blocking) في 5% milk في TBST.

قم بتحضينها لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة مع أجسام PRP المضادة. 3F4 و 1E4 مضادات N أو مضادات C؛ بعد التحضين مع أجسام مضادة ثانوية مقترنة بـ HRP، قم بتحضين الغشاء ومحلول التلألؤ الكيميائي وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة وعرض الفيلم كما هو موضح هنا مقارنة بعينات مرض كروتزفيلد جاكوب (CJD) الفجوي المتقطع. تم الكشف عن كمية صغيرة من PRP الخلوي غير القابل للذوبان في جزء P2 من الأدمغة الطبيعية.

ومع ذلك، تم استعادة معظم الكمية في الجزء S two. يمثل بروتين PRP غير القابل للذوبان ما يقرب من 5 إلى 25% من إجمالي PRP، بما في ذلك الأنواع كاملة الطول والأنواع المبتورة طرفياً. وكشفت التحليلات باستخدام ترسيب تدرج السكروز المتدرج أنه بينما تم استعادة معظم PRPC من أدمغة غير مصابة بمرض CJD في الأجزاء العلوية، فقد تم الكشف أيضاً عن كميات صغيرة من PRP في الأجزاء السفلية من تسعة إلى 11 التي تحتوي عادةً على تجمعات كبيرة. وتتنوع أنواع PRP الممرضة أو أنواع PRP SC، والتي تتراوح من المونومرات.

تم عزل أربطة أصغر وتجمعات أكبر عن طريق الترشيح الهلامي في الدماغ المصاب بمرض yakup ذو صمام CRUT. ومن المثير للدهشة، تم اكتشاف كمية صغيرة من التجمعات الأكبر ذات وزن جزيئي يزيد عن 2000 kilodaltons أيضًا في الأجزاء غير القابلة للذوبان من الأدمغة السليمة. علاوة على ذلك، لم يتم اكتشاف الثنائيات والرباعيات من PRPC في الأجزاء غير القابلة للذوبان فحسب، بل وأيضًا في الأجزاء غير القابلة للذوبان.

بعد المعالجة بـ PK و P NGAs. تم الكشف عن PRP الذي التقطه G five P باستخدام الجسم المضاد one E four ضد PRP 97 1 0 5 3. وقد تم الكشف عن شظايا لب مقاومة لـ PK أُطلق عليها PRP asterisk 20 و PRP asterisk 19 و PRP asterisk seven، حيث هاجرت عند 20 kilodaltons و 19 kilodaltons و 7 kilodaltons على التوالي.

ومع ذلك، لم يتم اكتشاف أي PRP عند تحضين الجسم المضاد one E four مسبقاً مع ببتيد اصطناعي له تسلسل مطابق لـ one E four epitope، مما يشير إلى أن النطاقات التي اكتشفها one E four هي شظايا PRP. وقد اكتشف الجسم المضاد anti C شظيتين مختلفتين من PRP تهاجران عند حوالي 18 kilodaltons وحوالي 12 إلى 13 kilodaltons. بالإضافة إلى طريقة PRP ETE 20 Once.

يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون أربعة أيام إذا تم تطبيقها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل تجمعات PRP الذائبة وغير الذائبة في الجزء السفلي من الدماغ البشري بعد تطورها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للأبحاث المتعلقة بمصير PIP لاستكشاف معلومات التأكيد في الدماغ.