قياس نشاط V عامل في البلازما البشرية باستخدام الفحص التخثر صفيحة ميكروسكوبية

كان الهدف العام من الإجراء التالي هو تطوير مقايسة في أطباق مجهرية لقياس نشاط بروتين التجلط العامل V أثناء تكوين جلطة الفبرين في البلازما البشرية. واستجابةً للإصابة، يتم تنشيط عملية تخثر الدم، مما يؤدي إلى سلسلة من تفاعلات تحويل الزيموجين (Xymogen) إلى بروتياز، والتي تؤدي في النهاية إلى إنتاج إنزيم التجلط ثرومبين، حيث يقوم الثرومبين بشطر الفبرينوجين القابل للذوبان إلى مونومرات الفبرين، والتي ترتبط بعد ذلك لتشكل جلطة فبرين غير قابلة للذوبان. وفي الحالة الطبيعية أو غير المصابة، يظل الدم سائلاً يتدفق بحرية، وتكون كمية الفبرين المتكونة مساوية لكمية الفبرين المتحلل أو المفكك.

ومع ذلك، في حالات مرضية معينة، يؤدي التخثر المفرط إلى أمراض القلب والسكتة الدماغية، بينما يؤدي نقص التخثر إلى نزعات نزفية، والتي تظهر غالباً في حالات الهيموفيليا. يُعد العامل V بروتيناً في البلازما، ويعمل في شكله المنشط factor five A كمسرع حيوي لتوليد الثرومبين أثناء تكوين خثرة الفيبرين كجزء من معقد إنزيم البروثرومبين؛ حيث يتكون البروثرومبين من أربعة مكونات وهي العامل 10 A، والبروتياز factor five A، والعامل المساعد الليبيدي (السطح)، والكالسيوم. يزيد factor five A من الكفاءة التحفيزية أو kcat للعامل 10 A تجاه ركيزته البروثرومبين بنحو 3000 ضعف، مما يعزز بشكل كبير توليد الثرومبين وتكوين خثرة الفيبرين.

تُفضل منصة الأطباق الدقيقة (microplate platform) لقياس الأحداث المحفزة بالإنزيمات نظراً لسهولة الاستخدام، وتوفير الوقت، وصغر أحجام العينات، وإمكانية المراقبة المستمرة، والإنتاجية العالية. ويمكن مراقبة عملية تكوين جلطة الفبرين باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة عن طريق قياس الزيادة في امتصاص الضوء للبلازما، حيث يتغير مظهرها من اللون الأصفر الشفاف مع عدم وجود جلطة فبرين وأدنى مستوى لامتصاص الضوء، إلى مظهر عكر معتم مع وجود جلطة فبرين وأقصى مستوى لامتصاص الضوء. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل فحوصات أنابيب الإمالة اليدوية أو الفحوصات باستخدام المحللات الآلية، في أن هذه الطريقة سريعة، وغير مكلفة، وتتطلب أحجام عينات صغيرة، وتتميز بإنتاجية عالية.

يقيس هذا المقايسة نشاط العامل الخامس المنشط غير المقصود والمنشط بالثرومبين للحصول على تقييم كمي كامل لنشاطه الوظيفي الكلي. وسيقوم ديريك تيلي، طالب الماجستير في المختبر، باستعراض هذه التقنية. ومن أجل قياس نشاط العامل الخامس في عينة بلازما، من الضروري إنشاء منحنيات قياسية لنشاط العامل الخامس أحادي المرحلة؛ وذلك من خلال قياس وقت تكوين خثرة الفيبرين في اللوحة A، والمعدل الأولي لتكون خثرة الفيبرين في اللوحة B، باستخدام بلازما بشرية طبيعية (NHP) كمعيار يحتوي بحكم التعريف على وحدة واحدة من نشاط العامل الخامس لكل ML. يتم إذابة البلازما المفتقرة للعامل الخامس، والبلازما البشرية الطبيعية، وعينات البلازما المجهولة، والثرومبوبلاستين عند 37 درجة لمدة 10 دقائق.

امزج البلازما الناقصة في العامل الخامس بلطف، ثم انقلها إلى صواني غسيل بلاستيكية منفصلة واحضنها على الثلج. احفظ البلازما البشرية الطبيعية وعينات البلازما المجهولة على الثلج بعد مزجها بلطف. احفظ كلوريد الكالسيوم 25 millimolar في ماء مقطر في صينية غسيل منفصلة في درجة حرارة الغرفة من أجل منحنيات القياس المعيارية لنشاط العامل الخامس في المرحلة الواحدة.

قم بتحضير 200 µL من التخفيفات التسلسلية المضاعفة لبلازما بشرية طبيعية بنسب 0، 2، 4، 8، 16، 32، 64، و1:28، و2:56، و512 ضعفاً في محلول HBS بـ pH 7.4 باستخدام أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 ml، مع الرج الجيد بجهاز الفورتكس والتحضين على الثلج. وبالنسبة لعينات البلازما المجهولة، قم بتحضير 200 µL من تخفيفات بمقدار 40 ضعفاً لكل من البلازما البشرية الطبيعية وعينات البلازما المجهولة في محلول HBS بـ pH 7.4 باستخدام أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 ML. ضع خمس شرائح من الآبار الدقيقة في حامل القالب الخاص بقارئ الأطباق الدقيقة.

قم بتشغيل قارئ الأطباق الدقيقة (Microplate reader) والوصول إلى برنامج Softmax Pro الخاص بتطبيقات الأطباق الدقيقة باستخدام ماصة متعددة القنوات. أضف 50 µL من بلازما الدم الناقصة في العامل الخامس (factor five deficient plasma) في وقت واحد إلى جميع آبار الطبق الدقيق للعينات باستخدام ماصة واحدة، ثم أضف 50 µL من 10 تخفيفات تسلسلية مُعدة من بلازما بشرية طبيعية، وتخفيفات بمقدار 40 ضعفاً من بلازما بشرية طبيعية وبلازما عينات مجهولة إلى آبار منفصلة في الطبق الدقيق باستخدام ماصة متعددة القنوات، ثم أضف 50 µL من الثرومبوبلاستين (thrombo plasty) إلى جميع آبار العينات. قم بالتحضين في قارئ الأطباق الدقيقة عند درجة حرارة 25 °C لمدة دقيقة واحدة، مع الرج لمدة تتراوح من 15 إلى 25 ثانية خلال دقيقة التحضين هذه.

باستخدام الكمبيوتر المتصل بقارئ الأطباق الدقيقة (MICROPLATE reader)، قم بالدخول إلى برنامج Softmax Pro Microplate. اضبط قارئ الأطباق الدقيقة على وضع طول موجة الامتصاص 405 نانومتر، ودرجة حرارة الحركية (kinetic temperature) على 25 درجة مئوية، وبرمج القارئ للاهتزاز خلال الثواني الخمس الأولى بعد إضافة كلوريد الكالسيوم، وقياس الامتصاص عند 405 نانومتر كل خمس ثوانٍ لمدة ست دقائق. بعد ذلك، لا يتم تضمين فترة الاهتزاز التي تبلغ خمس ثوانٍ في حسابات أوقات التجلط. وباستخدام ماصتين متعددة القنوات في وقت واحد، أضف 50 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم إلى شريطي الأطباق الدقيقة اللذين يحتويان على العينات.

انتظر لمدة 15 ثانية ثم اضغط فوراً على أيقونة البدء في برنامج Softmax Pro من جهاز الكمبيوتر لبدء المقايسة. وبالنسبة لكل عينة بلازما يتم تحليلها، يتم تحديد وقت تكوين الجلطة وتعريفه على أنه الوقت بالثواني للوصول إلى نصف الزيادة القصوى في الامتصاصية. أما المعدل الأولي لتكوين الجلطة فيُعرف بأنه معدل الزيادة في الامتصاصية خلال أول خمس نقاط زمنية من الجزء الخطي للزيادة في الامتصاصية مقابل الوقت.

يُعرَّف مدى تكوين الجلطة بأنه الفرق بين الحد الأقصى والحد الأدنى للامتصاصية التي تم تحقيقها أثناء عملية تكوين الجلطة في نهاية التشغيل. استخدم مخططات الامتصاصية مقابل الوقت في برنامج Softmax Pro لتحديد الوقت، والمعدل الأولي، ومدى تكوين الجلطة للتخفيف التسلسلي لبلازما بشرية طبيعية. ولإنشاء منحنيات القياس المعيارية لنشاط العامل V من المرحلة الواحدة، استخدم أوقات التجلط لبلازما بشرية طبيعية مخففة بمقدار 40 ضعفاً وعينات بلازما مجهولة لاستكمال استيفاء نشاط العامل V بوحدات لكل ملل من منحنى القياس المعياري لنشاط العامل V من المرحلة الواحدة.

يمثل هذا نشاط العامل الخامس في مرحلة واحدة أو النشاط بدون تنشيط متعمد بواسطة الثرومبين. هذا مثال تمثيلي لتكون خثرة الفيبرين في مقايسة العامل الخامس بمرور الوقت، والتي تم إنتاجها بواسطة قارئ الأطباق الدقيقة. يمثل هذا المخطط تكون خثرة الفيبرين باستخدام بلازما بشرية طبيعية مخففة 32 ضعفاً في طبق دقيق واحد.

حسناً، يشير المحور الرأسي إلى التغير في الامتصاصية عند 405 نانومتر والذي حدث نتيجة لتكون جلطة الفيبرين. وقد حُسب وقت تكون الجلطة على أنه نقطة المنتصف لمنحنى الامتصاصية مقابل الزمن، وهو 36.4 ثانية. كما حُسب المعدل الأولي لتكون الجلطة بـ 611.88 مللي وحدة في الدقيقة.

تَمّ حساب مدى تشكّل السحابة بقيمة 0.35 وحدة. ويقيس مقايسة العامل خمسة بدقة المعدل الزمني الأولي ومدى تشكّل السحابة. وقد أكد فحص الآبار عند اكتمال المقايسة حدوث تشكّل الخثرة.

وصلت جميع التفاعلات إلى نفس المدى تقريبًا من تكوين الخثرة، مع تغير عام في الامتصاصية عند 405 نانومتر يتراوح بين 0.35 و 0.45 وحدة بين الامتصاصية الابتدائية قبل عملية تخثر الدم وإضافة كلوريد الكالسيوم وبين أقصى امتصاصية بعدهما. تظهر في اللوحة A واللوحة B، على التوالي، أمثلة تمثيلية لنشاط العامل الخامس في مرحلة واحدة، ومنحنى قياسي لوقت التجلط بالثواني مقابل نشاط العامل الخامس بوحدات لكل مل، والمعدل الأولي لتكوين الخثرة بميلي وحدة في الدقيقة مقابل نشاط العامل الخامس بوحدات لكل مل لبلازما بشرية طبيعية.

بما أن العامل الخامس يتم تنشيطه عادةً بواسطة الثرومبين، فإن العامل المساعد النشط العامل الخامس A يتطلب مقايسة ثانية بعد الإضافة والحضن مع الثرومبين لقياس نشاط العامل الخامس ثنائي المرحلة في عينة البلازما بدقة، مع التنشيط المتعمد بواسطة الثرومبين المضاف في مقايسة العامل الخامس ثنائية المرحلة. قم بتحضير 200 إلى 300 µL من الثرومبين المنقى بتركيز نهائي قدره 100 nM في HBS pH 7.4 واحضنها على الثلج؛ ثم خفف 120 µL من البلازما البشرية الطبيعية وبلازما العينات من 40 ضعفاً إلى 100 ضعف باستخدام 170 µL من HBS pH 7.4 الذي يحتوي على 2.8 mM.

كلوريد الكالسيوم. أضف 10 µL من الثرومبين إلى كل عينة للوصول إلى تركيز نهائي قدره 10 nM. اخلط العينات بجهاز Vortex جيداً، ثم حضنها عند 37 °C لمدة دقيقة واحدة، ثم خفف بلازما الإنسان الطبيعية وبلازما العينات بمقدار 500 ضعف عن طريق إضافة 400 µL من HBS pH 7.4.

قم بتحديد وقت التجلط لبلازما بشرية طبيعية في كل مقايسة لعينات البلازما المجهولة من خلال مخططات الامتصاصية مقابل الوقت في برنامج soft max Pro. وبأخذ التخفيف بمقدار 500 ضعف في الاعتبار، استخدم وقت التجلط لكل عينة لحساب نشاط العامل الخامس في المرحلة الثانية من منحنى المعايرة أحادي المرحلة للعامل الخامس الذي يربط بين وقت التجلط والنشاط. ويمثل هذا نشاط العامل الخامس في المرحلة الثانية أو النشاط الناتج عن التنشيط المتعمد بواسطة الثرومبين.

يمكن بعد ذلك حساب نشاط العامل الخامس الكلي عن طريق طرح نشاط العامل الخامس في المرحلة الواحدة من نشاط العامل الخامس في مرحلتين. استُخدم المنحنى القياسي للوغاريتم زمن التجلط مقابل لوغاريتم نشاط العامل الخامس لقياس نشاط العامل الخامس في بلازما بشرية طبيعية وفي بلازما تسعة مرضى يعانون من التخثر المنتشر داخل الأوعية أو DIC. أظهر جميع مرضى DIC التسعة انخفاضاً في أنشطة العامل الخامس في المرحلة الواحدة ومعدلات تكوين الجلطة الأولية بنسبة 54% و18% على التوالي في المتوسط. كما انخفض نشاط العامل الخامس في مرحلتين والنشاط الكلي لدى مرضى DIC بنسبة 44% و42% في المتوسط مقارنة بالبلازما البشرية الطبيعية.

أدى نقص العامل الخامس ومرضى التخثر المنتشر داخل الأوعية (DIC) إلى إطالة الوقت وانخفاض معدل تكوين جلطة الليف. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فكرة جيدة عن كيفية تنفيذ هذه الطريقة في مختبرك. يمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة لقياس نشاط أي عامل تخثر في البلازما، مما يجعلها مناسبة لمجموعة واسعة من التطبيقات البحثية والسريرية.

وفي نهاية المطاف، ستؤثر هذه المعلومات المتعلقة بالعامل V إيجابياً على بيئات الرعاية الصحية من خلال التشخيص والعلاج المبكر لاضطرابات التخثر أو النزيف مثل DIC.