والثقافة الخلية العصبية الأولية نظام لدراسة فيروس العقبول البسيط الكمون وإعادة تنشيط

تهدف هذه التجربة إلى توضيح كيفية استخدام نظام زراعة الخلايا العصبية الأولية لدراسة كمون فيروس الهربس البسيط وإعادة تنشيطه. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل الخلايا العصبية من العقد الرقبية العليا لأجنة الجرذان (RA)، ثم زراعة الخلايا العصبية المعزولة من العقد المفككة بعد التخلص من الخلايا غير العصبية. ويتم إنشاء عدوى HSV كامنة باستخدام فيروس EGFP لإصابة الخلايا العصبية في وجود مثبط للتضاعف الحالة.

تتمثل الخطوة التالية في تحفيز إعادة تنشيط المستنبتات المصابة الكامنة. وأخيرًا، يتم تقييم كفاءة إعادة التنشيط من خلال مراقبة تعبير EGFP بمرور الوقت. وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج توضح كيف تنظم مسارات الإشارات العصبية المختلفة كمون فيروس الهربس البسيط وإعادة تنشيطه من خلال استخدام المثبطات الكيميائية، وتداخل الحمض النووي الريبي (RNA interference)، ونقل الجينات.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في أنها تتيح إجراء دراسات تفصيلية للتفاعلات التي تنظم كمون فيروس الهربس البسيط في عصبون المضيف على المستوى الجزيئي. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال كمون فيروس الهربس البسيط، مثل: ما هي الإشارات التي تعمل على كبح الجينوم الكامن، وكيف يتم تحفيز إعادة التنشيط على المستوى الجزيئي؟ وفي العصبونات، يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤى حول كمون HSV one.

ويمكن تطبيق هذا الإجراء أيضاً على فيروسات هيربس ألفا العصبية الأخرى. سيقوم بتوضيح الإجراء كل من ماريكو كوشي وجوليان كيم، وهما طالبان في مرحلة الدراسات العليا في مختبراتنا. يتم عزل عصبونات العقد الرقبية العلوية (SCG) لهذا البروتوكول من صغار الجرذان في اليوم الجنيني 21 (E 21)، والتي استُخرجت من رحم أنثى جرذ حامل. وباستخدام غطاء التشريح، يتم التضحية بكل جرو عن طريق توجيه المقص إلى قاعدة الرقبة فوق الكتفين مباشرةً وفصل الرأس عن الجذع. ولكشف العقد، تُستخدم إبر قياس 23 لتثبيت الرأس من جهة الرقبة في ثلاثة مواقع.

أولاً، قم بتثبيت الحبل الشوكي. ثانياً، اسحب الجلد الأمامي فوق الأنف وقم بتثبيته، وثالثاً قم بتثبيت المريء والقصبة الهوائية بعيداً عن الجزء الخلفي من الرقبة. ابحث عن العقدة الرقبية العلوية (SCG) من خلال تحديد موقع تفرع الشريان السباتي.

يُعد الشريان السباتي تركيباً مزدوجاً. توجد تفرعان على كل جانب من جانبي الرقبة، وبالتالي يوجد اثنان من الـ S CGS لكل فرد. يقع الـ SCG أسفل التفرع مباشرة.

افصل العقدة العصبية الرقبية العليا (SCG) عن الشرايين عن طريق سحب التفرع بعيداً باستخدام الطرفين. تكون العقدة العصبية الرقبية العليا شفافة وعديمة اللون مقارنة بالأنسجة الدهنية المصفرة والمعتمة التي تحيط بالتفرع. ضع العقد العصبية في 12 milliliters من L 15.

وسط غذائي مضاف إليه الجلوكوز في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter على الثلج. بعد جمع كافة الـ SCGs من الأجنّة وسحبها بلطف، يتم طرد العقد مركزياً لمدة دقيقة واحدة، وبسرعة 600 RPM، ثم يُزال الوسط الغذائي الزائد.

قم بتعليق العقد في 1 mL من وسط L 15 الذي يحتوي على التريبسين والكولاجيناز. يتم التحضين لمدة 24 دقيقة عند 37 °C.

قم بالرج كل ثماني دقائق. بعد ذلك، أضف 10 milliliters من الوسط البحري لتعطيل التربسين باستخدام جهاز الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة. وبسرعة 600 RPM، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من وسط التربسين والكولاجيناز، ثم اغسل العقد العصبية باستخدام 10 milliliters من وسط C عبر جهاز الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة بسرعة 600 RPM.

كرر عملية الغسل هذه مرة واحدة. تخلص من وسط الغسل وأعد تعليق العقد في 1 mL من وسط C لتفكيكها عن طريق التثليق باستخدام إبرة قياس 21 مثبتة في محقنة سعة 5 mL لمدة لا تتجاوز 15 دورة من التحريك للأعلى والأسفل. أكمل عملية التثليق باستخدام إبرة قياس 23 حتى تتفكك معظم التجمعات.

قم بإزالة أي تكتلات متبقية من الخلايا عن طريق ترشيح العصبونات المفككة باستخدام مرشح نايلون بمسامية 70 micron في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. اسحب عينة قدرها 10 microliter من معلق الخلايا المرشح، الممزوج بصبغة triam blue لتحديد عدد الخلايا الحية. قم بعدّ الخلايا التي تستبعد الصبغة بنشاط باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer).

بعد ذلك، وزع من 5,000 إلى 6,000 خلية حية إجمالاً في 100 µL من الوسط C في كل بئر من أطباق زراعة الأنسجة ذات الـ 96 بئراً والمطلية مسبقاً بالكولاجين واللامينين، مع تضمين 50 ng/mL من عامل نمو الأعصاب في الوسط C. يتم التحضين طوال الليل عند 37 °C، وفي اليوم التالي، وهو اليوم الأول في المختبر أو DIV 1، يتم التحقق من الالتصاق الصحيح للعصبونات ونمو بعض الإسقاطات المحورية.

استبدل الوسط C في الآبار بـ 50 µL من الوسط العصبي القاعدي (neuro basal medium) أو NBM الذي يحتوي على NGF Acho و five fluoro two doxy uridine. استبدل الأوساط صفاً تلو الآخر لضمان عدم جفاف الخلايا. حضن المزارع عند 37 °C لمدة خمسة أيام.

راقب المزرعة يومياً للتأكد من موت الخلايا غير العصبية ونمو الخلايا العصبية. لبدء هذا الجزء من الإجراء في اليوم السادس من الزراعة المختبرية (in vitro)، تحقق من إزالة غالبية الخلايا الداعمة غير العصبية. ومن الأهمية بمكان تقليل التلاعب الفيزيائي غير الضروري بالخلايا العصبية في جميع الأوقات.

يجب إزالة الوسط الغذائي واستبداله برفق شديد وببطء، وإلا فإن الإجهاد الميكانيكي الناتج قد يؤثر على حيوية العصبونات. أضف aciclovir أو CV إلى الوسط الموجود في كل بئر ليصل إلى تركيز نهائي قدره 100 micromolar. أضف CV ببطء وبرفق لضمان عدم تأثير القوة الميكانيكية سلبًا على الخلايا في اليوم التالي.

في اليوم السابع من الزراعة (DIV seven)، يتم إصابة مزارع SCG بفيروس HSV 1 معاد التركيب يعبر عن مراسل EGF مدمج مع البروتين الحلولي الفيروسي US 11، بمضاعف إصابة (multiplicity of infection) يتراوح بين 1 إلى 2. أضف الفيروس المخفف مباشرة إلى الوسط الغذائي الموجود في البئر. تضمن تجربة ضابطة مصابة وهمياً (mock infected control) وإصابة حلولية (lytic infection).

ضابط موجب في أوساط تفتقر إلى CV. اترك العدوى تستمر لمدة تتراوح من ساعتين إلى ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك، استبدل أوساط العدوى بـ NBM طازج يحتوي على NGF وCV. من الضروري توخي الحذر الشديد عند تغيير أوساط العدوى؛ قم بإمالة الطبق نحوك وأزل الأوساط ببطء من قاع البئر.

ثم وجه طرف الماصة نحو جدار البئر بدلاً من القاع، واترك الوسط ينزلق بلطف فوق الخلايا. استبدل الوسط في صف واحد في كل مرة لمنع جفاف الخلايا. أعد المزارع إلى الحاضنة، مع التعامل معها بأكبر قدر ممكن من الرفق لتجنب التأثير سلباً على قدرتها على دعم كمون HSV one.

حافظ على المزارع لمدة ستة أيام عند 37 درجة مئوية، وهي الفترة التي سيقوم خلالها الفيروس بتأسيس حالة الكمون. خلال هذه الفترة، استخدم مجهراً فلورياً لمراقبة تعبير us 11 EGFP كمؤشر على التكرار الحالة التحللية.

كما هو متوقع، لا ينبغي أن يكون هناك تعبير عن GFP في عينة التحكم المصابة وهمياً. يجب الكشف عن S 11 EGFP في عينات العدوى فقط. تشير آبار التحكم الإيجابية التي تفتقر إلى معالجة CV إلى نجاح العدوى الأولية والتضاعف التحليلي المنتج.

لتقييم إعادة التنشيط في اليوم 14 من الزراعة (DIV 14)، استبدل بعناية الوسط الذي يحتوي على CV بوسط جديد يخلو من CV كما تم سابقاً. وجه طرف الماصة نحو جدار البئر بدلاً من قاعه، واسمح للوسط بالانزلاق بلطف فوق الخلايا إذا كان ذلك مناسباً. أضف المتغيرات الفارماكولوجية أو البيولوجية مثل LY 2 9 0 0 4 بتركيز 20 micromolar.

لا ينبغي رصد أي تعبير عن GFP في المزارع المصابة كامنًا والمعالجة بـ A CV. أعد الخلايا إلى درجة حرارة 37 درجة مئوية على مدار فترة تتراوح من خمسة إلى ستة أيام. راقب المزارع الحية باستخدام مجهر فلوري للكشف عن العصبونات التي تمر بمرحلة إعادة التنشيط.

يتم حساب تردد إعادة التنشيط عن طريق عدّ عدد الآبار التي تحتوي على عصبونات موجبة لـ EGFP والتعبير عن ذلك كنسبة من العدد الإجمالي لآبار العينات. يوضح هذا الشكل مثالاً يتم فيه تطبيق trigger statin، وهو محفز معروف لإعادة التنشيط، على مستنبتات SCG المصابة في مرحلة متأخرة. تمت مراقبة إعادة التنشيط وتقييمها باستخدام المجهر الفلوري يومياً بعد العلاج الدوائي لمدة خمسة أيام.

باستخدام TSA، يصل إعادة التنشيط إلى 50% من الحد الأقصى في غضون يومين، وبحلول اليوم الخامس، يصل إعادة التنشيط إلى 60%؛ بينما يمثل DMSO مستوى الأساس أو إعادة التنشيط التلقائي. بلغت نسبة المزارع الضابطة المعالجة في هذه التجربة 10% تقريبًا، وتتراوح عادةً بين 5% إلى 20% باستخدام هذا النظام في المختبر. كما تمت معالجة مزارع SCG المصابة في مرحلة متأخرة باستخدام LY 2 9 0 0 4.

تمت مقارنة مزارع إعادة التنشيط الناتجة عن محفز معروف لإعادة التنشيط بواسطة LY مع المزارع المعالجة بمثبط تخليق الحمض النووي الفيروسي، phospho، no acetic acid، وكلا المركبين معاً كما هو موضح هنا، حيث يتأثر تعبير US 11 EGFP بفعل PAA في المزارع المحفزة لإعادة التنشيط بواسطة LY 2 9 4 0 0 2 مما يشير إلى أن تعبير US 11 EGFP يعتمد على تضاعف الحمض النووي الفيروسي. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم إيلاء اهتمام دقيق للتقنية المعقمة والتعامل مع مزرعة CG بأكبر قدر ممكن من الرفق لتجنب زيادة إعادة التنشيط التلقائية الناتجة عن الإجهاد أو الحركات الميكانيكية. وبعد اتباع هذا الإجراء لإنشاء عدوى HSV one كامنة في الخلايا العصبية المزرعة، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل S-H-R-N-A، والتعطيل الجيني (knockdown)، والتعبير ectopic للجينات من النوع البري والطفرات المفقودة من أجل توصيف الوظائف العصبية التي تنظم كمون HSV one وإعادة تنشيطه.

تذكر أن فيروس HSV 1 هو مسبب مرض بشري يتطلب احتياطات السلامة من المستوى الحيوي الثاني (BSL 2). يجب أن تكون على دراية بالعمل في ظروف المستوى الحيوي الثاني قبل تنفيذ هذا الإجراء. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء مستنبتات SCG لإحداث عدوى كامنة بفيروس HSV 1، وكيفية تحفيز إعادة التنشيط في الخلايا العصبية بشكل فعال.