المستمدة زراعة والتطبيقات تناوب الحائط تفاعلات الاحيائية سفينة 3D نماذج الخلايا الظهارية

يقدم هذا البروتوكول غير التقليدي نظاماً سهلاً وقوياً لاستزراع الخلايا الظهارية البشرية في نماذج ثلاثية الأبعاد شبيهة بالأعضاء تحاكي الأنسجة البشرية في الجسم الحي. أولاً، تُستزرع الخلايا الظهارية حتى تصل إلى طبقة أحادية متصلة في قارورة زراعة الأنسجة ثم تُحصد، وبعد ذلك تُدمج مع خرزات حاملة دقيقة في مفاعل STLV الحيوي، مع تدوير STLV على المنصة لخلق بيئة سقوط حر ثابتة ذات قص سائل منخفض، مما يسمح للخلايا بالالتصاق والنمو على الخرزات وتكوين تجمعات خلوية بعد 96 ساعة وتقريباً في كل يوم تالٍ لذلك.

قم بتجديد الوسط الغذائي في الـ SDLV لتعويض الاستهلاك الناتج عن التمثيل الغذائي الخلوي عند تكوين التجمعات، وقم بتصوير العينات باستخدام المجهر الضوئي أسبوعياً لمراقبة التقدم التطوري بمجرد اكتمال تكوين التجمعات والتمايز الخلوي. قم بنقل التجمعات لغرض التحليل التجريبي والمقايسات اللاحقة. وفي النهاية، يمكن لهذا النظام توليد نماذج عضوية شبيهة بما يحدث داخل الجسم الحي للعديد من الاستقصاءات العلمية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنةً بالطرق الحالية مثل زراعة الخلايا التقليدية، في أن الخلايا الظهارية ستتمايز وتستقطب إلى تجمعات تشبه الأنسجة، وبالتالي تسلك سلوكاً مشابهاً من الناحية المورفولوجية والوظيفية للأنسجة البشرية الأصلية. يوفر نظام النموذج ثلاثي الأبعاد هذا رؤية أعمق في بيولوجيا الخلايا الظهارية، وتفاعلات المضيف مع الممرضات، والتفاعل المعقد بين أنواع الخلايا التي يمكن إدخالها في النظام. الدكتورة أندريا رادكي.

سيقوم الآن باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري باستعراض هذا الإجراء لإزالة سمية المفاعل الحيوي الوعائي الجانبي بطيء الدوران. قم بتغطية المنافذ المفتوحة باستخدام سدادات اللور (lure caps). املأ المفاعل STLV بـ 95% ethanol واتركه ليتوازن لمدة 24 ساعة.

قم بإزالة الإيثانول، ثم املأ الوعاء بالماء المقطر المعقم وحضنه لمدة 24 ساعة باستخدام الأدوات المقدمة من المورد، وقم بفك جميع البراغي وإزالة السدادة المركزية من جهاز STLV. ضعها في كيس تعقيم وعقمها بجهاز الأوتوكليف عند 110 درجة Celsius لمدة 20 دقيقة. أعد تجميع جهاز STLV وكرر عملية إزالة السموم لضمان التعقيم.

بعد ذلك، قم بشد براغي صمام STLV. ثم قم بتوصيل صمام غلق أحادي الاتجاه معقم مسبقاً بكل منفذ. الآن، قم بإزالة المكبس من محقنة لور لوك (lure lock) سعة 10 ملي لتر وأخرى سعة خمسة ملي لتر، وضع المكابس في أغلفتهما.

للحفاظ على التعقيم، قم بربط المحاقن بصنبور الإيقاف. باشر بإضافة DPBS إلى المحقنة سعة 10 milliliter حتى يمتلئ STLV وتبدأ المحقنة سعة five milliliter في الامتلاء. بعد ذلك، أعد تركيب المكبس المعقم في كل محقنة وأزل أي فقاعات متبقية في المفاعل الحيوي عن طريق التناوب في دفع مكابس المحاقن.

أغلق صمامات التوقف وثبّت جهاز STLV على المنصة الرأسية الدوارة. قم بالتدوير لمدة 24 ساعة على الأقل لمراقبة وجود أي تسرب في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. أضف 15 milliliters من DPBS إلى 250 milligrams من حبيبات cyto dex microcar وقم بالتعقيم بالبخار بعد التبريد.

قم بإزالة غسول DPBS ثلاث مرات باستخدام وسط استزراع الخلايا الظهارية. قم بتدوير الأنبوب لإعادة تعليق الخرزات. ثم أعد تعليق الخرزات في 15 milliliters من وسط الاستزراع.

أولاً، يتم استزراع 1 × 10⁷ من الخلايا الظهارية كطبقات أحادية في دوارق زراعة الأنسجة. يتم حصاد الخلايا ثم عدّها وتحديد حيويتها عن طريق صبغ استبعاد تريبان الأزرق، ثم تُضاف الخلايا إلى الخرزات المُحضّرة.

اشطف الأنبوب المخروطي لضمان نقل جميع الخلايا. بعد ذلك، قم بإزالة DPBS والمحاقن من STLV. كما يجب إزالة السدادة من المنفذ المركزي باستخدام ماصة سيرولوجية سعة 10 milliliter.

قم بتحميل معلق حبيبات الخلايا الظهارية في جهاز STLV. اشطف الأنبوب المخروطي مرة واحدة لنقل جميع الخلايا والحبيبات. ثم أعد تركيب سدادة المنفذ المركزي.

بعد ذلك، قم بإزالة المكبسين من حقنة سعة 5 mL وحقنة سعة 10 mL وضع المكبسين في أغلفتهما. وللحفاظ على التعقيم، قم بربط فتحات الحقنة بصنابير إيقاف مفتوحة. ثم املأ الـ STLV بالوسط الزرعي.

استبدل المكبسات وأغلق الصمام. الآن، قم بموازنة مزرعة STLV التي تم استزراعها حديثاً في حاضنة عند درجة حرارة 37 degree Celsius لمدة 30 minutes بدون تدوير. بعد إخراج STLV من الحاضنة، افتح الصمام.

قم بإزالة أي فقاعات باستخدام المكبسات ثم أغلق صمام الإيقاف. بعد ذلك، اضبط جهاز STLV على الدوران المستمر بسرعة 20 RPM داخل الحاضنة. وبعد مرور 96 إلى 120 ساعة، قم بتغيير الوسط الغذائي عن طريق إزالة المحاقن وفتح كلا صمامي الإيقاف في جهاز STLV للسماح للخرز والخلايا بالترسب.

بمجرد استقرار الخلايا، قم بسحب حوالي 75% من الوسط الغذائي من المنفذ الجانبي باستخدام المحاقن لتنفيذ بروتوكول التغذية. ومرة أخرى، استمر في تعويض الوسط الغذائي حسب الحاجة بناءً على عملية التمثيل الغذائي الخلوي. كما يجب مراقبة نمو وحيوية التجمعات كل خمسة إلى سبعة أيام.

لتجنب تكسر التجمعات، استخدم رأس ماصة سعة 1000 ميكرولتر تم قصه على بُعد حوالي سنتيمترين من الطرف وتعقيمه. قم بإزالة 200 ميكرولتر من التجمعات بعناية من الفوهة المركزية ووزعها على أنبوبين سعة 1.5 مليلتر. استخدم إحدى هاتين الحصص لمراقبة الحيوية الخلوية. بعد فصل الخلايا عن الحبيبات، قم بتقييم الحيوية باستخدام طريقة استبعاد صبغة تريبان الزرقاء (trypan blue).

التصبيغ لتصوير التجمعات الخلوية. أضف 0.5 إلى 1 مل من الوسط إلى الجزء الثاني من عينة التجمعات بحجم 1.5 مل وانقله إلى طبق بتري صغير باستخدام طرف ماصة 1000 ميكرولتر مقصوص. صوّر التجمعات.

عند استخدام مجهر ضوئي مقلوب لبعض نماذج الخلايا الظهارية، من الضروري نقل التجمعات إلى وعاء نصف كروي مخصص للاستخدام مرة واحدة لزيادة تهوية المزرعة قبل حوالي أسبوع من حصاد التجمعات. ولغرض التحليل، قم بإزالة المحاقن من جهاز STLV وأفرغ حوالي 50% من الوسط من المنفذ الجانبي. ثم قم بإزالة السدادة المركزية واسكب جميع المحتويات بعناية في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter من المنفذ المركزي.

اشطف STLV مرتين باستخدام 5 mL من الوسط الغذائي واجمع محاليل الشطف مع التجمعات التي تم حصادها. بعد ذلك، انقل التجمعات من الأنبوب المخروطي سعة 50 mL إلى Harv. بعد مرور أسبوع واحد، احصد التجمعات بعناية لاستخدامها في أنماط المقايسات والمقايسات والتحليلات المحتملة؛ حيث تم تنمية تجمعات ظهارية بشرية متمايزة في نظام المفاعل الحيوي STLV.

تَم جمع صور المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) والمجهر الإلكتروني النافذ (TEM) من خلايا مهبلية بشرية نَمَت في جهاز STLV لمدة 39 يوماً. يُلاحظ أن التجمعات ثلاثية الأبعاد تُظهر سمات بنيوية دقيقة مشابهة للأنسجة، بما في ذلك الحواف الدقيقة، والانغمادات، والحويصلات الإفرازية داخل الخلايا، والخملات الدقيقة على السطح القمي. كما تشير صور المجهر الفلوري المناعي البؤري للخلايا المهبلية ثلاثية الأبعاد إلى تعبير عن الميوسين وعلامات محددة للخلايا الظهارية والتمايز النهائي. وتعمل هذه الأنماط الظاهرية ذات الصلة الفسيولوجية أيضاً كمنصة ممتازة لتقييم سمية المركبات.

يمكن استخدام مقايسة MTT، وهي مقايسة شائعة الاستخدام لقياس حيوية الخلايا أو التمثيل الغذائي أو التكاثر، لقياس السمية تجاه مختلف المواد الكيميائية والمركبات. وبدلاً من ذلك، يمكن قياس السمية بعد المعالجة بمركبات الاختبار عن طريق استبعاد صبغة tripan blue. في هذا المثال، أظهرت التجمعات المهبلية، بعد المعالجة بمركب NONOXINOL nine، استجابة سمية مشابهة لنماذج cervical X explan، ولكن بملف تعريف مختلف مقارنة بالطبقات الأحادية.

تتميز التجمعات ثلاثية الأبعاد بأنها مستجيبة وظيفياً، على سبيل المثال، عند تحفيزها بجزيئات مشتقة من الميكروبات التي تتعرف عليها مستقبلات toll-like. وتستجيب هذه التجمعات عن طريق إفراز السيتوكينات المحفزة للالتهاب، بما في ذلك بروتين IL six والتعبير النسخي لمستقبل البروجسترون. كما يمكن ملاحظة وجود مستقبل يستجيب للتحفيز الهرموني في الخلايا المهبلية.

لا تملك التجمعات ثلاثية الأبعاد القدرة على الاستجابة لجزيئات الممرضات والهرمونات فحسب، بل يمكنها أيضاً دعم عدوى فيروس الهربس البسيط من النوع الثاني وظيفياً. وتُظهر صورة مجهر بؤري (confocal microscopy) لتجمعات مهبلية ثلاثية الأبعاد مصابة بفيروس HSV 2 حدوث العدوى. كما يمكن قياس الخصائص الفيزيائية والوظيفية للخلايا الفردية داخل التجمعات باستخدام قياس التدفق الخلوي (flow cytometry)، فعلى سبيل المثال، يمكن إجراء مقايسة قياس التدفق الخلوي لقياس تعبير muc1 السطحي على الخلايا المهبلية الفردية.

أظهرت التجمعات المهبلية ثلاثية الأبعاد نسبة أقل من الموكين 1 (muck one) على سطحها مقارنة بالطبقات أحادية الخلية بعد تطورها. وقد أتاحت هذه التقنية للباحثين في مجالات بيولوجيا الأنسجة والأمراض المعدية دراسة البنية والاستجابات الفسيولوجية للمنبهات. ومن خلال استخدام هذه النماذج العضوية، نتمكن من محاكاة البيولوجيا البشرية بشكل أفضل.