توصيف المظهري والوظيفي للخلايا غشائي مستعمرة تشكيل المستمدة من الإنسان دم الحبل السري

الهدف العام من هذا الإجراء هو شرح كيفية استخلاص الخلايا المكونة للمستعمرات البطانية أو e CFCs من دم الحبل السري البشري. ويتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة الخلايا وحيدة النواة من دم الحبل السري أولاً، ثم استنساخ وتوسيع نموات المستعمرات من e CFCs. وتتمثل الخطوة الثانية في توصيف الخلايا مخبرياً باستخدام تقنية تحليل خلوي فردي مبتكرة لتقييم إمكانات التكاثر النسيلي.

أخيراً، يتم توصيف الخلايا من خلال مقايسة تكوين الأوعية الدموية في الجسم الحي، وذلك عن طريق إنتاج وزرع هلامات تحتوي على E CFCs في فئران nod skid. وفي النهاية، يمكن تقييم تكوين أوعية دموية جديدة ممتلئة بدم المضيف في الجسم الحي عن طريق صبغ H and E للغرسات الخلوية التي تحتوي على ECFC. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنيات مقارنة بالطرق الحالية في أنها تسمح بفحص القدرة التكاثرية للخلايا البطانية على مستوى الخلية الواحدة.

يمكن توسيع نطاق تطبيقات هذه التقنية للبحث عن أدوات تشخيصية وعلاجية لأمراض مثل مرض الشرايين المحيطية أو PAD لأن هذه التقنية تتيح لنا فحص القدرة التكاثرية والقدرة الجينية للخلايا البطانية للمريض. قبل البدء في الإجراء، أضف 1 ml من كولاجين ذيل الجرذ، النوع الأول، في كل بئر من أطباق زراعة الأنسجة ذات الستة آبار، ثم حضّن الطبق طوال الليل؛ وفي يوم الإجراء، قم بتوزيع دم الحبل السري في وحدات سعتها 15 ml داخل أنابيب طرد مركزي مخروطية سعتها 50 ml. ثم أضف 20 ml من PBS إلى كل أنبوب وقم بسحب الخليط ودفعه بالماصة عدة مرات.

بعد ذلك، اسحب 15 ملليلتر من fial PA باستخدام ماصة، وضع طرف الماصة في قاع أنبوب الدم المخفف وقم بإضافة fial PA بعناية. قم بطرد الأنابيب مركزياً لمدة 30 دقيقة بسرعة 740 ×g في درجة حرارة الغرفة مع إيقاف تشغيل مكبح التباطؤ. بعد فصل الخلايا، استخدم ماصة نقل لإزالة الطبقة الضبابية من الخلايا أحادية النواة منخفضة الكثافة الموجودة عند الواجهة بين fial peak والبلازما المخففة. ضع الخلايا التي تم جمعها في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من وسط E GM two، وقم بترسيب الخلايا أحادية النواة لمدة 10 دقائق بسرعة 515 ×g في درجة حرارة الغرفة مع تفعيل إعداد مكبح التباطؤ العالي، ثم اسحب السائل الطافي وتخلص منه بعناية.

بعد ذلك، وبعد غسل الخلايا المترسبة باستخدام EGM two مرتين، قم بتعليق الخلايا أحادية النواة في EGM two بتركيز 1.25 × 10⁷ خلية/ملل. الآن، انقل 4 ملل من معلق الخلايا أحادية النواة إلى كل بئر من آبار الطبق المغطى بالكولاجين، واترك الخلايا في الحاضنة حتى تتشكل المستعمرات في اليوم الأول. بعد التحضين، قم بإزالة الوسط المستنفد من الآبار ببطء باستخدام ماصة دون تحريك الخلايا ضعيفة الالتصاق.

ثم أضف بعناية 4 mL من E GM two إلى الآبار وأعد الطبق إلى الحاضنة. تظهر المستعمرات عادةً بين اليومين الخامس والرابع عشر، أي قبل يوم من الإجراء. يتم استخدام 50 µL من كولاجين ذيل الجرذ.

أضف النوع الأول إلى كل بئر من آبار طبق يحتوي على 96 بئراً كما سبق، ثم حضّن الطبق طوال الليل في يوم الإجراء. ابدأ بغسل الخلايا التي تم تمريرها من مرتين إلى ثلاث مرات فقط، وذلك بغسلها مرتين باستخدام PBS. بعد سحب الغسلة الأخيرة من PBS، ضع أسطوانة استنساخ مغطاة بهلام معقم حول كل مستعمرة، مع الضغط على كل أسطوانة بإحكام مقابل الطبق باستخدام ملقط معقم.

أضف قطرتين إلى ثلاث قطرات من محلول triple E express الدافئ في كل أسطوانة استنساخ، ثم قم بتحضين الأسطوانات لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق حتى تبدأ الخلايا في الانفصال. بعد أن تبدأ الخلايا في الانفصال، أضف حوالي 250 µL من وسط EGM two إلى مركز الأسطوانة، واستخدم الماصة في سحب وعزل السائل صعوداً وهبوطاً لإنتاج معلق من الخلايا المفردة. الآن، انقل معلق الخلايا المفردة من كل أسطوانة استنساخ على حدة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق منفصل.

قم بإصابة الخلايا في طبق سداسي الفجوات بفيروسات لينتيفيروس التي تعبر عن EGFP، ثم اجمع الخلايا التي تعبر عن EGFP باستخدام قياس التدفق الخلوي الفلوري. بعد ذلك، قم بحضن الخلايا الموجبة لـ EEG FP وEGM two في الأطباق المغطاة بالكولاجين. وعندما تصبح E CFCs جاهزة، اجمعها باستخدام trip E express كما تم توضيحه للتو، ثم أعد تعليق الخلايا في وسط e GM two بتركيز نهائي يبلغ تقريباً 10^6 خلية/mL.

بعد ذلك، وباستخدام جهاز فرز الخلايا بالتدفق (flow sorter) وبمعدل تدفق منخفض يبلغ 20 خلية في الثانية، يتم فرز خلية واحدة فقط من خلايا ECFC الإيجابية لـ EGP في كل بئر ضمن صفيحة 96 بئراً المطلية بالكولاجين والمجهزة مسبقاً، مع ضبط الحجم النهائي لكل بئر باستخدام EGM two ليصل إلى 200 microliters تقريباً لكل بئر. ثم استخدم مجهراً فلورياً مقلوباً للتأكد من أن كل بئر يحتوي على خلية واحدة فقط. تُحضن الصفيحة لمدة أسبوعين مع تغيير الوسط الغذائي مرتين، وذلك في اليوم 14 من الزرع.

اغسل كل بئر بـ 100 µL من PBS قبل تثبيت الخلايا باستخدام 100 µL من 4%paraform aldehyde لمدة 30 دقيقة. بالنسبة لخلايا CFCs التي لا تعبر عن EGFP، أضف كاشف cyt، وهو صبغة نووية فلورية خضراء، بعد التثبيت بـ para formaldehyde واحضنها عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. استخدم مجهراً فلورياً لتحديد عدد الخلايا البطانية المتوسعة كمياً بشكل مرئي كما هو موضح هنا؛ وتعتبر الآبار التي تحتوي على عدد من الخلايا البطانية يتراوح من 2 إلى 50 عبارة عن تجمعات خلايا بطانية.

تُعتبر الآبار التي تحتوي على 51 إلى 2000 خلية ذات إمكانات تكاثرية منخفضة من e CFCs، بينما تُعتبر الآبار التي تحتوي على 2001 خلية أو أكثر ذات إمكانات تكاثرية عالية من e CFCs. بعد فصل الخلايا باستخدام triple E express كما سُبق، يتم الحصول على عدد الخلايا الحية في المزرعة الخلوية باستخدام hemo, cytometer و trian blue. يتم نقل 2.4 million من الخلايا الحية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter، ثم يتم تجميع الخلايا في شكل كريّة عن طريق الطرد المركزي أثناء تدوير الخلايا لأسفل.

اخلط مكونات مصفوفة الهلام جيداً، ثم اضبط قيمة الـ pH لتصبح 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم مع الحفاظ على المحلول في الثلج. بعد التخلص من السائل الطافي، أعد تعليق الراسب في 360 µL من وسط e GM two الدافئ. بعد ذلك، أضف 840 µL من محلول مصفوفة الهلام إلى الخلايا واخلط المحلول بعناية حتى يتم تعليق الخلايا تماماً في الهلام. انقل هذا المليلتر الواحد من معلق الهلام الخلوي إلى عين واحدة من طبق زراعة أنسجة مكون من 12 عيناً، ثم قم بتحضين الطبق حتى يتبلمر الهلام.

بعد ذلك، وقبل التحضين طوال الليل، قم بتغطية الهلام برفق بـ 2 mL من وسط EGM two الدافئ. وفي اليوم التالي، ومباشرة قبل الزرع، استخدم مقصات القزحية لتقسيم اله}], إلى قطعتين متساويتين، ثم أعد قطع الهلام إلى نفس بئر الزرع التي تحتوي على وسط EGM two. وبعد التأكد من التخدير عن طريق قرص إصبع القدم، قم بحلاقة أسفل بطن فأر من نوع nod, skid مخدر يتراوح عمره بين 5 إلى 6 أسابيع، ونظف موقع الجراحة جيداً باستخدام مسحات الكحول والبيتادين.

بعد ذلك، استخدم مقص قزحية حاد ومعقم لإجراء شق بطول خمسة مليمترات تقريبًا في الربع السفلي من البطن، وذلك للكشف عن الفراغ تحت الجلد بين الجلد وعضلة البطن. قم بتشريح الطبقة الجلدية تشريحًا غير حاد (Blunt dissection) بعيدًا عن عضلة البطن في منطقتين مختلفتين من البطن لإنشاء جيوب بعرض 15 إلى 20 مليمتر، بحيث يؤدي أحدها إلى الربع العلوي من البطن والآخر إلى منطقة أخرى من البطن. ثم ارفع الطبقة الجلدية الموجودة مباشرة عند الشق.

أدخل قطعة واحدة من نصف الجل في أحد الجيوب البطنية، والقطعة الأخرى من نصف الجل في الجيب البطني الآخر. بعد إدخال الجل، أغلق كل شق بخرزتين إلى ثلاث غرز باستخدام خيوط جراحية من البولي بروبيلين مقاس 5-0 على إبرة قاطعة. قم بتسمية بطاقات الأقفاص وأجرِ المراقبة ما بعد الجراحة والتسكين وفقاً لمتطلبات المؤسسة والبروتوكول.

بعد التضحية بالحيوان في اليوم 14 من الزرع، امسح بطن الفأر بمسحات كحولية واقطع الجلد موازياً لخط الشق الأصلي. ثم استأصل سدائل من الجلد موازية للموقع المحتمل للهلامات. قم بإجراء قطوع دائرية حول الهلامات لإزالة كل زرعة، ثم ضع الزرعات المستأصلة في مثبت الزنك.

باستخدام تقنية اشتقاق الخلايا البطانية المكونة للمستعمرات (ECFC) هذه، لاحظنا نمو تكوين مستعمرات أولية في وقت مبكر من اليوم الخامس. لاحظ المورفولوجيا الشبيهة بحجر الرصف لمزارع ECFC في اليوم الخامس كما تشير رؤوس الأسهم. تعبر المستعمرات المتوسعة عن المستضدات البطانية، ولكنها لا تعبر عن المستضدات المكونة للدم.

كما هو موضح في هذا التقييم المظهري التمثيلي في المختبر للخلايا البطانية والمكونة للدم، كشف التنميط المناعي أن خلايا e CFCs تعبر عن المستضدات البطانية مثل CD 31 وCD 34 وCD 1 44 وCD 1 46 وFL one وflick one وflip four وNRP two، ولكنها لم تعبر عن المستضدات المكونة للدم CD 45 وCD 14 وCD 11 وBC Kit وCXCR four أو CD 1 33. ومن المهم ملاحظة ما يمثله هذا الرسم البياني الشريطي، حيث تُظهر المستعمرات الموسعة تسلسلاً هرمياً كاملاً لإمكانات التكاثر النسيلية على مستوى الخلية الواحدة، والتي تتراوح من تجمعات مكونة من خليتين إلى 50 خلية وصولاً إلى مستعمرات تزيد عن 2001 خلية. تم الحصول على هذه الصور المجهرية للمستعمرات المصبوغة بـ cyt، وهو صبغ نووي فلوري أخضر، بعد زراعة خلايا E CFCs المشتقة من دم الحبل السري على مستوى الخلية الواحدة لمدة 14 يوماً.

علاوة على ذلك، تُشكل خلايا ECFC أوعية دموية بشرية يتم ترويتها بخلايا دم حمراء من المضيف عند زرعها في فئران تعاني من نقص المناعة. وفي صبغة H&E هذه لغرسات هلام CELLULARIZE التي تحتوي على خلايا ECFC المشتقة من دم الحبل السري، يمكن ملاحظة أوعية دقيقة مملوءة بخلايا دم حمراء من المضيف تكونت في هلام الكولاجين والفبرونيكتين بعد 14 يوماً من الزرع. وهنا، يؤكد صبغ anti-human CD 31 باللون البني الأصل البشري لهذه الأوعية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اشتقاق الـ ECFCs من دم الحبل السري البشري، وكيفية استنساخ مستعمرات ECFC وتوسيعها وتوصيف وظائفها بعد تطويرها. لقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في البطانة الوعائية لاستكشاف إمكانات التكاثر النسيلي والقدرة الجينية للخلايا البطانية التي يتم الحصول عليها من مصادر متعددة.