الطمع القائم على فحص التفاعل خارج الخلية (AVEXIS) للكشف قابلة منخفضة تقارب التفاعلات مستقبلات يجند خارج الخلية

الهدف العام من هذا الإجراء هو اكتشاف تفاعلات بروتينية جديدة خارج الخلوية تشارك في عمليات التعرف الخلوي، وبشكل خاص البروتينات المستقبلة المدمجة في الغشاء. تم تصميم نهج AveXis للالتفاف على ألفات التفاعل الضعيفة جداً التي تميز هذه الفئة من التفاعلات البروتينية، وحقيقة أن البروتينات الغشائية يصعب التعامل معها كيميائياً حيوياً. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تجميع مكتبة بروتينات مأشوبة للمناطق خارج الخلوية للمستقبلات الموجودة على سطح الخلية.

يتم تحقيق ذلك من خلال تصميم بلازميدات تعبير لإنتاج مناطق النطاق الخارجي للمستقبلات كقطع قابلة للذوبان، وذلك في شكل طعوم أحادية المير مُوسومة بالبيوتين، ومسابير خماسية المير مُوسومة بإنزيم. وتتمثل الخطوة الثانية في التعبير عن البروتينات ومعايرتها لتصبح جاهزة لفحص التفاعل. ويتم إنتاج جميع البروتينات في خلايا ثديية لضمان إضافة تعديلات ما بعد الترجمة مثل الروابط ثنائية الكبريتيد والارتباط بالسكريات.

تتمثل الخطوة الحاسمة في البروتوكول في التأكد من أن جميع بروتينات الطُعم (bait) والفريسة (prey) داخل المكتبة قد تم توحيد معاييرها ضمن مستويات العتبة المحددة. بعد ذلك تأتي المرحلة المثيرة، وهي الفحص عن التفاعلات الجديدة. يتم توزيع الطُعوم في آبار فردية لصفيحة ميكروية، ثم يتم فحص التفاعلات باستخدام الفريسة.

بعد ذلك، يتم إجراء خطوة غسيل. وتتمثل الخطوة النهائية في إضافة الركيزة الخاصة بالإنزيم للكشف عن أي فرائس مُلتقطة على مصفوفات البروتينات الطُعم. وفي النهاية، يمكن لنتائج فحص VEX أن توضح أي من مستقبلات سطح الخلية قادرة على تكوين شركاء ارتباط، وبالتالي قد تكون مشاركة في عمليات التعرف والتواصل بين الخلايا.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بطرق استخلاص البروتينات الشائعة، مثل نظام الخميرة ثنائي الهجين أو التنقيات الكيميائية الحيوية، في أنها مصممة خصيصاً للكشف عن التفاعلات البروتينية-البروتينية خارج الخلوية. وهي مناسبة بشكل خاص لاكتشاف تفاعلات جديدة بين البروتينات المستقبلة المرتبطة بالغشاء. يصعب الكشف عن هذه التفاعلات باستخدام تقنيات أخرى لأن البروتينات الغشائية يصعب التعامل معها كيميائياً حيوياً، كما أن تفاعلات مستقبلاتها المقابلة تكون عادةً ضعيفة للغاية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية تتعلق بكيفية تعرف الخلايا على بعضها البعض وتواصلها. وعلى المستوى الجزيئي، يمكن استخدامها للإجابة على أسئلة تتعلق بالعمليات البيولوجية الأساسية، مثل تحديد بروتينات المستقبلات المعروضة على سطح البويضات والحيوانات المنوية التي اتحدت مع بعضها البعض، أو تحديد تفاعلات المستقبل والربيطة المسؤولة عن السلوكيات الخلوية مثل اندماج الخلايا العضلية أو تكوين العرف العصبي. ويكمن التحدي الرئيسي في هذا النهج في تجميع مكتبات البروتينات بنظام "الطُعم والصلاة" (bait and pray) التي يتم من خلالها فحص التفاعلات.

من المهم جداً أيضاً التأكد من أن البروتينات الطعم (bait) والفريدة (prey) قد تم توحيد معاييرها ضمن مستويات العتبة المطلوبة للمقايسة. وهذا يقلل من تكرار النتائج السلبية الخاطئة والإيجابية الخاطئة. لقد خطرت لي الفكرة الأولى لهذه الطريقة أثناء دراستي للدكتوراه عندما كنت أحاول تحديد شريك ارتباط لبروتين سطح الخلية CD 200.

في الجوهر، كنت أتساءل عن نمط الارتباط الخاص بمستقبل سطح الخلية هذا تحديداً؟ وحتى اليوم، لا يزال هذا السؤال صعب الإجابة من الناحية التقنية. ومع ذلك، كان الجينوم البشري قد شارف على الاكتمال في ذلك الوقت، وأدركت أنه بما أننا نمتلك الآن قائمة كاملة بجميع مستقبلات سطح الخلية في الجينوم، يمكننا بدلاً من ذلك أن نتساءل عن البروتينات التي يمكنها التفاعل تقنياً ضمن هذه المجموعة من البروتينات المستقبلة.

هذا السؤال أسهل بكثير في الإجابة، وكانت طريقة AveXis هي ما طورناه للإجابة عليه. بمجرد إنشاء مكتبة من نواقل الطعم (bait) ونواقل الفريسة (prey) للتعبير الجيني، يتم التحضير لنقلها (transfect) إلى خلايا HEC 2 9 3 E؛ ابدأ بزراعة الخلايا في اليوم السابق لعملية النقل بكثافة 250,000 خلية لكل milliliter في 50 milliliters من وسط freestyle 2 9 3 لضمان كفاءة عملية الـ biotinylation. قم بتدعيم الوسط المستخدم لإنتاج بروتينات الطعم، وليس بروتينات الفريسة، بـ d biotin. وبعد تحضير جميع الأطباق، تُحضن الخلايا طوال الليل في ظروف قياسية.

نظرًا لأن البيوتين يتميز بقابلية ذوبان منخفضة، فإننا نفضل وزن كمية إضافية من البيوتين ثم إضافتها إلى الوسط الغذائي ورجّها بقوة في اليوم التالي. يتم ترنسفكشن 50 ملليلتر من الخلايا المستزرعة باستخدام 25 ميكروجرام من بلازميد الطعم (bait) أو الفريسة (prey) باستخدام كاشف ترنسفكشن مناسب لإنتاج طعوم مبيوتنة، مع إجراء ترنسفكشن مشترك لبناء الطعم بنسبة 10 إلى 1 مع البلازميدات التي تشفر شكلًا مفرزًا من بروتين ELI biotin ligase قبل الحصاد.

تُجمع المزارع بعد خمسة أيام من عملية عفن الخلايا (transfection)، وذلك أولاً عن طريق ترسيب الخلايا باستخدام جهاز الطرد المركزي عند 3000 ×g لمدة 20 دقيقة، وثانياً عن طريق ترشيح السائل الطافي عبر مرشح بمسامية 0.22 ميكرون. إحدى الميزات الرئيسية لنظام AveXis هي أنه نظراً لإفراز البروتينات المأشوبة، يمكن تخفيفها أو تركيزها لتكون ضمن حدود النشاط المطلوبة. وقد وجدنا أن البروتينات المأشوبة تظهر تبايناً في التعبير يصل إلى أربعة أوامر مقدارية، لذا فإن خطوة التوحيد القياسي (normalization) تقلل من حدوث النتائج الإيجابية الكاذبة خلال خطوات الفحص.

لبدء عملية تطبيع الطعم، يجب إزالة الـ de biotin غير المقترن من الوسط عن طريق الديلزة، لأنه سينافس بروتين الطعم المبيوتن على الارتباط بمواقع الارتباط في الـ strept؛ ابدأ بتثبيت الطعم في أنبوب ديلزة. ولضمان ديلزة فعالة للبروتينات المؤشبة، وجدنا أنه من المهم توفير مساحة سطح زائدة لأنبوب الديلزة. وعادةً ما نوفر أنبوباً يزيد طوله بمقدار مرتين إلى ثلاث مرات عن الطول المطلوب فعلياً للحجم الذي يتم إجراء الديلزة له.

على مدار 24 ساعة، يتم إجراء عملية ديالة مكثفة للطُعم مقابل محلول منظم مناسب مثل PBS بعد إتمام عملية الديالة. تبدأ تقنية ELIZA بحجب آبار طبق ميكرو تيترا بطلاء مشفر بالستريبتوكوكوس باستخدام PBST المحتوي على BSA لمدة 15 دقيقة. وفي الوقت ذاته، يتم تحضير سلسلة من أربعة تخفيفات بمعدل 1 إلى 3 لبروتينات الطُعم في PBST مع 2% BSA على طبق نظيف.

بعد فترة تحضين مدتها 15 دقيقة، انقل التخفيف إلى الطبق المشفر بـ strep TTR وحضن الطبق لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، وبعد مرور ساعة، اغسل الآبار ثم أضف إلى كل بئر 100 µL من OX 68 بتركيز 2 µg/mL. حضن الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة أخرى. بعد التحضين الثاني، قم بإجراء سلسلة غسيل أخرى ثم حمّل الطبق بـ anti-US alkaline phosphatase.

قم بتحضين الطبق لساعة ثالثة في درجة حرارة الغرفة. الآن، اغسل الطبق ثلاث مرات باستخدام PBST ثم قم بغسله غسلة نهائية باستخدام PBS. لإزالة أي منظف متبقٍ، أضف 100 µL من مادة substrate 1 0 4 بتركيز 1 mg/mL في محلول di ethanol amine buffer بعد مرور ساعة.

في درجة حرارة الغرفة، قم بقياس الامتصاصية عند 405 نانومتر. تم الكشف عن سلسلة تخفيف من أربعة سوائل علوية مختلفة من الطُعم المديال (dialyzed bait supinate) باستخدام تقنية Eliza بواسطة جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لـ CD four tag. إذا كانت بروتينات الطُعم المُعبر عنها غير المخففة غير كافية لإشباع جميع مواقع ارتباط البيوتين في لوحة مغطاة بـ strep avid ENC، فقم بتركيز البروتين باستخدام Viva spin concentrator. وخلاف ذلك، استخدم بروتين الطُعم بتركيز مخفف في PBST مع 2% BSA.

تعتبر هذه الكمية كافية لإشباع موقع ارتباط البيوتين الخاص بالمقايسة. قم بتقدير المستويات النسبية التي يتم عندها التعبير عن البروتينات الأولية باستخدام نشاط إنزيم بيتا لاكتاماز. ابدأ بعمل سلسلة تخفيفات للراشح الذي يحتوي على البروتينات الشاذة في محلول PBST 2%BSA المنظم.

بعد ذلك، أضف 20 µL من التخفيف إلى 60 µL من محلول nitrous stepin المحمل في طبق. انقل الطبق فوراً إلى قارئ الأطباق وقم بقياس الامتصاصية عند 485 nanometers مرة كل دقيقة لمدة 20 دقيقة التالية باستخدام مركزات طرد مركزي أو تخفيف PBST مع 2%BSA. اضبط التركيز النهائي للعينات لتحليل جميع الـ nitros في المقايسة في غضون سبع دقائق تقريباً، وهو ما يعادل حوالي two ol nitros turnover في الدقيقة.

ابدأ عملية فحص AveXis بغسل لوحة مطلية بـ TAVR ENC من نوع strep باستخدام محلول PBST، ثم جفف اللوحة عن طريق النقر عليها مقابل منشفة ورقية. بعد ذلك، أضف محلول PBST مع BSA إلى كل بئر واحضن اللوحة لمدة 30 دقيقة؛ وذلك لحجب مواقع ربط البروتين الزائفة.

من كل بئر، قم بإزالة محلول الحجب عن طريق هز اللوحة ببراعة فوق حوض الغسيل، ثم أضف 100 µL من الطعم أحادي القسيمة المبيوتين الموحد إلى الآبار المناسبة. قم بتحضين اللوحة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بإزالة عينات الطعم من اللوحة بهزة أخرى واغسلها ثلاث مرات باستخدام PBST.

ثم جفف بالتربيت بعد الغسلة الثالثة. الآن أضف 100 µL من بنية الفريسة الخماسية الموحدة إلى كل بئر، واحضن الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد مرور ساعة، اغسل الطبق ثلاث مرات إضافية باستخدام PBST، ثم غسلة نهائية باستخدام PBS فقط.

أخيرًا، أضف 60 µL من محلول nitrous seven إلى كل بئر واترك اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين، أو يُفضل تحضين اللوحات لمدة 16 ساعة عند 4 °C. وفي اليوم التالي، ستتحول التفاعلات الإيجابية إلى اللون الأحمر. التقط صورة للوحة لتوثيقها بصرياً، ثم قم بقياس كمية التفاعلات عند امتصاصية 485 nanometers باستخدام قارئ اللوحات.

بعد حوالي 10 دقائق من بدء تفاعل فحص AveXis، لوحظ تحول اللون من الأصفر إلى الأحمر في كل من تحكم التقاط الفريسة بوساطة الأجسام المضادة وأيضاً في تفاعل التحكم الإيجابي. يشير هذا التغير اللوني إلى تحلل النيتروس في الركيزة. تظهر بعض التفاعلات الإيجابية في هذا النطاق الزمني، ولكن معظمها استغرق بضع ساعات للظهور.

عادةً ما يُلاحظ معدل إصابة يتراوح بين 0.4 و0.6% من الإيجابيات. وبمجرد تحضير مكتبات البروتينات، يمكن تنفيذ جزء الفحص من هذه التقنية بسرعة. ومن الممكن جداً فحص ما يصل إلى 12 لوحاً في اليوم الواحد بعد تحديد التفاعل.

تتمثل الخطوة التالية الأكثر أهمية في إثبات إمكانية تكرار هذا التفاعل أولاً باستخدام تحضيرات بروتينية مستقلة وجديدة. ثانياً، نقوم دائماً بتحديد ما إذا كان التفاعل مستقلاً عن توجيه الطعم والفريسة، أي هل يمكن عكس العملية؟ ويتضمن ذلك استنساخ نطاقات ناقل الطعم في ناقل الفريسة والعكس صحيح.

تعتبر التفاعلات التي يمكن تكرارها وتبادلها عالية الموثوقية، وقد ثبت دائمًا أنها إيجابية. وباستخدام تقنيات أخرى مثل رنين البلازمون السطحي، نفضل استخدام رنين البلازمون السطحي للتحقق بشكل إضافي من أي تفاعلات نعيد تحديدها. ومن المهم أن هذا يقدم برهانًا على أن المكونين المنقيين يمكنهما التفاعل بشكل مباشر، كما يمكن استخدامه لإظهار أن الارتباط مشبع وبالتالي فهو محدد.