تقنية الفحص المجهري للTIRF التصوير، في الوقت الحقيقي في وقت واحد من TCR وما يرتبط بها من البروتينات اشارة

يصف هذا الفيديو إجراءً لتتبع أحداث إشارات مستقبلات الخلايا التائية باستخدام الاستحواذ المتزامن ثنائي القناة. مجهر الفلورة بالانعكاس الداخلي الكلي أو مجهر TIRF؛ أولاً، يتم ترنسفكشن الخلايا التائية بـ بلازميد يشفر ZAP 70 الموسوم بـ GFP، ثم يتم تحضير طبقة ليبيد ثنائية مدعومة بزجاج، والتي تدمج معقدات MHC ببتيدية مثبتة بالليبيد، وجزيئات الالتصاق، والجزيئات المحفزة المشتركة.

تُضاف الخلايا التائية المنقولة جينياً ببروتين ZAP 70 إلى الطبقة الثنائية عندما يتم تحفيز مستقبلات الخلايا التائية بواسطة معقدات peptide MHC. تخضع سلاسل CD three المرتبطة بمستقبل الخلايا التائية للفسفرة بواسطة كيناز LCK من عائلة SARC، ويتم استدعاء كيناز zap 70 من السيتوبلازم. بعد ذلك، يتم وسم مستقبل الخلايا التائية فلورياً وإجراء التصوير حيث تُغمر الخلايا في وسط ذي معامل انكسار أقل من غطاء الشريحة الزجاجية وتُضاء بشعاع ليزر بزاوية تخضع للانعكاس الداخلي الكلي.

يؤدي ذلك إلى توليد موجة متلاشية عند الواجهة الفاصلة بين الزجاج والماء، والتي تضمحل أسياً داخل الوسط، مما يسمح بعمق اختراق يتراوح من 100 إلى 200 nanometers. وبذلك، يتم استثارة الفلوروفورات الموجودة في الغشاء البلازمي أو القريبة جداً منه فقط. ويكشف تحليل الصور الناتجة أن عملية نقل الإشارات تحدث في العناقيد الدقيقة لمستقبلات الخلايا T.

تكمن الميزة الرئيسية لمجهر الفلورة بالانعكاس الداخلي الكلي أو المجهر البؤري التقليدي في الحصول على دقة أفضل، مما يسمح بتصور تجمعات الإشارات أو المعقدات الإشارية مثل التجمعات الدقيقة لمستقبلات الخلايا التائية (TCR micro clusters) بسهولة. سيقوم ترافيس كرايتس وتشين، وهما باحثان في مرحلة ما بعد الدكتوراه في مختبري، بتوضيح كيفية ترانزفكشن خلايا T الأولية للفئران باستخدام تقنية maxi nucleo affection، ومن ثم تصويرها باستخدام مجهر الفلورة بالانعكاس الداخلي الكلي (TIRFM) المحفزة بطبقة دهنية ثنائية من مادة glass of bird تحتوي على المستضد.

لقد استُخدمت هذه الطريقة على نطاق واسع لدراسة نقل الإشارات في مختلف الخلايا المناعية، بما في ذلك الخلايا التائية والخلايا البائية والخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا الصارية. وتتميز هذه الطريقة بقابلية تطبيق واسعة، حيث يمكن استخدامها لدراسة معظم أنظمة المستقبلات في الخلايا الثديية، خاصة إذا كان نقل الإشارات يحدث في تجمعات. وقد يواجه المبتدئون في استخدام هذه الطريقة صعوبة في البداية نظراً لصعوبة إجراء عملية عفن الخلايا التائية.

بالإضافة إلى ذلك، يتطلب الأمر تنسيقاً دقيقاً لضمان وصول حيوية الخلايا التائية وكفاءة عفن الخلية (transfection)، وجودة البيلار، وكذلك محاذاة المجهر إلى المستوى المطلوب. تتمثل الخطوة الأولى من هذا الإجراء في عفن إما الخلايا التائية الأولية الساذجة (naive) أو المنشطة في المختبر باستخدام بلازميدات التعبير وجزيئات الإشارة المشفرة والموسومة بـ GFP، وذلك باستخدام طقم AM maxa mouse T-cell nucleo effector. أعربت جميع الخلايا التائية المستخدمة في هذه الدراسة عن A-N-D-T-C-R الذي يتعرف على ببتيد MCC الموجود في جزيء MHC IE الخاص بـ K. يتم تنفيذ إجراء العفن الموضح هنا وفقاً لتوصيات الشركة المصنعة.

ومع ذلك، تُقدم بعض النصائح التي تعزز حيوية الخلايا التائية (T cells) بعد عملية عفن transfection. وتكون كل من الحيوية وكفاءة transfection أعلى في الخلايا التائية المنشطة مختبرياً (in vitro) مقارنة بالخلايا الساذجة (naive cells)، ولذلك يستخدم هذا البروتوكول خلايا تائية منشطة مختبرياً قبل البدء. قم بتحضير ملي لترين من وسط الخلايا التائية المكمل لكل عملية transfection عن طريق دمج 1.9 milliliters من الوسط المتوفر في الطقم، و 20 microliters من المكون A، و 20 microliters من المكون B، و 100 microliters من مصل الجنين البقري في أنبوب سعة ملي لترين.

انقل 2 mL من الوسط إلى كل بئر في طبق مكون من 12 بئراً. ضع الطبق في حاضنة رطبة عند 37 °C لمدة ساعة واحدة على الأقل للسماح للوسط بالوصول إلى حالة التوازن، حيث سيؤدي تعليق الخلايا المنقولة في وسط بارد أو وسط لا تبلغ قيمة الـ pH له 7.2 إلى موت الخلايا. لتحضير خليط النقل الجيني، ادمج 82 µL من محلول NucleoEffector للخلايا التائية للفئران مع 18 µL من المكمل الثاني و 5 µg من الحمض النووي البلازميدي الخالي من السموم الداخلية بتركيز لا يقل عن 0.5 µg/µL، ثم اخلط المزيج جيداً عن طريق النقر.

انقل من 5 إلى 10 ملايين خلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 milliliter، ثم قم بإجراء الطرد المركزي عند 75 ×g لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. استخدم شفاطاً تفريغياً لإزالة أكبر قدر ممكن من السائل الطافي، ثم أعد تعليق كتلة الخلايا في خليط ترانسفكشن (transfection) برفق، وقم بشفط كتلة الخلايا ببطء من ثلاث إلى أربع مرات حتى تختفي جميع التجمعات الخلوية الكبيرة. وباستخدام ماصة، انقل المعلق بعناية إلى وعاء amaxa معتمد، مع التأكد من عدم وجود فقاعات هواء.

قم بتعيين برنامج المؤثر النووي qve select nuclear effector program X 0 0 1 على جهاز المؤثر النووي. أدخل الـ vete في حامل Q vete واضغط على الزر لتطبيق البرنامج المختار. ثم انقل الـ vete ووسط الاستنبات الموازن مسبقاً على الفور إلى غطاء التدفق الصفائحي (الـ hood).

باستخدام الماصة البلاستيكية المتوفرة، أضف حوالي 500 microliters من الوسط المتوازن مسبقاً إلى الفجوة. بعد ذلك، أضف معلق الخلايا إلى الوسط في الطبق، وذلك قطرة تلو الأخرى.

قم بتحضين الخلايا عند 37 °C لمدة أربع ساعات للسماح بتعبير منخفض المستوى للبروتينات الموسومة بـ GFP ولتقليل ظهور الشوائب الناتجة عن الإفراط في التعبير. في هذا القسم، يتم وصف طريقة لمحاذاة المجهر للتصوير المتزامن بقناتين قبل تشغيل جميع مكونات المجهر. ابدأ بتشغيل الكمبيوتر والبرمجيات.

بعد ذلك، تأكد من أن البرنامج قد تعرّف على جميع المكونات المادية. وبما أن البرنامج بدأ التشغيل دون ظهور أي رسائل خطأ، فهذا يعني أنه تم اكتشاف جميع المكونات. قم بتخفيف واحد µL من المحلول الفرعي.

أضف الكرات الدقيقة المتعددة الفلورية الساطعة من Flores إلى 2 mL من PBS لاستخدامها كمعيار للتوضع المشترك. ثم أضف 0.25 mL من معلق الكرات الدقيقة إلى كل بئر من نظام Lab Tech المكون من ثماني غرف على شريحة غطاء زجاجي. ضع نظام الشريحة الغرفي على المنصة فوق الشيئية.

بعد ذلك، قم بضبط تركيز حبيبات الامتصاص على الزجاج في نافذة العرض المباشر. يمثل الجزء الأيسر القناة التي ستظهر فيها الخلايا التي تم تحويلها بواسطة GFP. أما الجزء الأيمن فسيعرض TCR المسمى أثناء تجارب تصوير الخلايا الحية.

باستخدام محاذاة محور Y في نظام XY، Z لإطلاق الألياف، اضبط موضع شعاع الليزر بحيث يخرج الشعاع من الشيئية ويُسقط على السقف. من المهم القيام بذلك عندما تكون الشيئية في الموضع الذي يكون فيه المستوى الزجاجي في بؤرة التركيز. إذا كان الشعاع على السقف منتشرًا، فهذا يعني أن الشعاع غير موازي.

قم بضبط الميكرومتر Z لتحقيق محاذاة كاملة لكل من خطوط الليزر التي سيتم استخدامها في التجربة. ثم باستخدام مقياس قدرة الليزر، اضبط قدرة الليزر لتكون بين 20 و 30 micro watts لكل قناة. الخلايا التائية حساسة للغاية للإشعاع الليزري، لذا يجب أن يقتصر الإضاءة على إجمالي مجمع قدره 50 micro watts.

بعد ذلك، يتم ضبط زاوية الـ turf. قم بتدوير ميكرومتر المحاذاة Y في وحدة إطلاق الألياف لتحريك الشعاع بعيداً عن السقف حتى تقترب زاويته، بالنسبة للمحاور البصرية للأهداف، من 90 درجة.

بمجرد الوصول إلى الزاوية الحرجة للانعكاس الداخلي الكلي، لن يخرج ضوء الليزر من الشيئية. ولتقييم ما إذا كان قد تم تحقيق محاذاة العشب (turf alignment)، قم بالتركيز صعوداً وهبوطاً عبر مستوى الزجاج الغطائي. لاحظ هنا أنه عند خروج الخرزات الممتصة على السطح من نطاق التركيز، يمكن رؤية العديد من الخرزات وهي تطفو في المحلول. ولتحقيق محاذاة عشب جيدة، من الضروري زيادة زاوية الشعاع بالنسبة للشيئية.

مع زيادة زاوية الحزمة، تبدأ الخرزات العائمة بالقرب من السطح في الاختفاء، بينما تزداد شدة الخرزات الممتصة عند الواجهة. والآن، عندما تصبح الخرزات الممتصة عند الواجهة خارج نطاق التركيز، لا تبقى أي خرزات عائمة في المحلول مرئية. عند هذه النقطة، يكون التوجيه قد تم ضبطه بشكل صحيح، حيث تكون الخرزات الممتصة على غطاء الشريحة فقط هي القادرة على أن تكون في نطاق التركيز.

بعد ذلك، ولمحاذاة القنوات الفلورية الحمراء والخضراء بالنسبة لبعضهما البعض، ركز على الخرزات وقارن موضع المعالم المحددة في الصور الناتجة عن كلا القناتين. وباستخدام براغي الميكرومتر X و Y الموجودة على حامل إحدى الكاميرات، اجعل الموضع النسبي للخرزات متقارباً قدر الإمكان. لاحظ الخرزة الساطعة في الربع السفلي الأيسر من كلتا الصورتين لضمان المحاذاة المكانية بين القناتين.

يتم وضع هذه الميزة في نفس الموضع النسبي في كلتا الصورتين. قم بالتقاط وحفظ الصورة من كلا القناتين. ستُستخدم هذه الصور كمعيار للتوضع المشترك لمحاذاة القناتين.

يظهر هنا مثال على هذا المحاذاة قبل إجراء العملية. تكون إحدى القنوات مدورة بالنسبة للأخرى كما هو موضح في هذه الصورة التي تظهر تراكب صور من قناتين لخرزات ذات دقة فرعية. وبعد إجراء التعديلات، تصبح الصور محاذية كما هو موضح هنا.

يمكن تدقيق جودة المحاذاة بشكل أكبر من خلال مقارنة صور خلايا حية مُصابة بـ GFP. لاحظ كيف أن منصة Laila من القناتين محاذاتان تماماً، وذلك بعد محاذاة الصورتين باستخدام المعايرة التي تم إنشاؤها باستخدام الخرزات الدقيقة الفلورية.

بمجرد إعداد المجهر، يتم تحضير غرف التدفق التي تحتوي على طبقات ليبيدية ثنائية مدعومة بالزجاج وتعرض المستضد، ويتم إجراء turf M لتصور تفاعل الخلايا التائية TRANSFECTED مع الركيزة أولاً. وفقاً للبروتوكول الذي وصفه Ana وDustin، يتم تجميع غرفة تدفق تحتوي على طبقات ليبيدية ثنائية مستوية تشكلت على شريحة غطاء زجاجية تحتوي على ليبيدات NI NTA، وجزيء الالتصاق ICAM one، ومعقدات ببتيد MHC. يتم دمج MCC loaded IEFK في الطبقة الثنائية عبر وسوم الهيستيدين.

يتم دمج الجزيء المُحفز المشترك CD 80. باستخدام مرساة GPI، ضع خلية التدفق على منصة المجهر وثبتها عن طريق ربط الغرفة بلوحة محولة على منصة المجهر باستخدام قضيب شد لتثبيتها. بعد ذلك، قم بتركيب عنصر التسخين المرفق من الشركة المصنعة على خلية التدفق للتحكم في درجة حرارتها.

ضع العدسة الشيئية فوق طبقة ثنائية واجعل مستوى الطبقة الثنائية في بؤرة التركيز لتمكين تسخين العدسة والخلية التدفقية، ثم قم بتشغيل سخانات الخلية التدفقية والعدسة الشيئية لرفع درجة حرارة الغرفة إلى 37 °C. بعد فترة تحضين تستمر لأربع ساعات، انقل خلايا T المقطوعة إلى أنبوب سعة 15 milliliter وقم بطردها مركزياً بسرعة 80 ×g. أعد تعليق الخلايا في 300 µL من محلول H-B-S-B-S-A المنظم. ثم أضف H 57 FAB أو جزء متغير أحادي السلسلة H 57 لوسم TCR بتركيز نهائي قدره 10 µg/mL لـ fab أو 20 µg/mL للجزء المتغير أحادي السلسلة.

انقل الخلايا إلى أنبوب فالس (fax tube) سعة خمسة ملليلتر. بعد ذلك، وباستخدام حقنة ذات طرف منزلق سعة واحد ملليلتر، احقن الخلايا في غرفة التدفق عبر صمام ثلاثي الاتجاهات. اضبط شروط التصوير بحيث يعرض الاستحواذ المباشر ثنائي القناة معاينة حية لقنوات TCR وGFP، ثم ابحث عن حقل يحتوي على خلايا محولة.

نظرًا لاختلافات الكثافة بين TCR وGFP، قد يلزم ضبط مقياس الصور في الوقت الفعلي لتمكين رؤية الخلايا في كلتا القناتين. وكما هو الحال هنا، يتم التأكد من إضاءة الـ turf من خلال التركيز التصاعدي على المستوى الزجاجي للكشف عن أي صبغ غشائي جانبي. إذا لم تظهر الأغشية الجانبية في نطاق التركيز، فإن محاذاة الـ turf جيدة.

في هذه المعاينة المباشرة، يظهر صبغ الغشاء الجانبي بوضوح في مستوى شريحة التغطية وأيضاً عند تحريك شريحة التغطية بعيداً عن بؤرة التركيز لضبط محاذاة المجهر بشكل جيد. تزداد زاوية الليزر بالنسبة للعدسة الشيئية، ويخرج الغشاء الجانبي عن بؤرة التركيز. ابدأ بالتقاط صور فردية وتسلسلات زمنية بفواصل زمنية مدتها 10 seconds.

تم تحضين الخلايا لمدة خمس دقائق على طبقات ثنائية من الزجاج والـ INTA تحتوي على ست جزيئات لكل ميكرومتر مربع من الببتيد المحمل بـ hist tagged IEFK، و 100 جزيء لكل ميكرومتر مربع من Alexa 647 conjugated hist tagged ICAM 1، و 100 جزيء لكل ميكرومتر مربع من GPI anchored CD 80. تم إجراء مجهرية TIRF ذات استحواذ متزامن ثنائي القناة في وجود مستمر لـ Alexa 546 conjugated H57 FAB fragment.

لتصبيغ TCR، تم تصوير الخلايا حتى مرور ساعة واحدة بعد الاتصال الأولي بالطبقة المزدوجة. وتم تحليل أعداد عناقيد ZAP 70 لكل خلية باستخدام برنامج مؤتمت لعد العناقيد. كما تم تحليل 40 خلية على الأقل في كل حالة.

تظهر الببتيدات المُحمّلة في الشكل الداخلي. يشير ICAM one إلى الخلايا الموجودة على طبقات ثنائية تحتوي على 100 جزيء لكل ميكرومتر مربع من ICAM one المرتبط بـ Alexa 6 4 7 والـ His tagged. كما هو موضح في الشكل، يحدث التأشير المعتمد على zap 70 في العناقيد الدقيقة لـ TCR وفقط استجابةً للربيطات المناهضة (agonist ligands) كما يمكن رؤيته في هذا المقطع، والذي تم تصويره بمعدل 10 ثوانٍ لكل إطار.

يتم الحفاظ على إشارات مستقبلات الخلايا التائية (TCR) استجابةً للببتيدات الناشطة من خلال التوليد المستمر للعناقيد الدقيقة لـ TCR في محيط منطقة التلامس التي تجذب ZAP 70. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية ترنسفكشن الخلايا التائية الأولية باستخدام تقنية maxa nuclear affection وتصوير تجنيد جزيئات إشارات GFPT إلى العناقيد الدقيقة لـ TCR بشكل صحيح باستخدام مجهر turf. بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في سبع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

عند محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر التعامل برفق شديد مع الخلايا الأولية. فكلما كانت الخلايا أكثر صحة في كل خطوة من خطوات التجربة، زادت كفاءة عفن الخلايا (transfection efficiency) وزاد عدد الخلايا التي ستلتقطها في التصوير. وتتميز الخلايا التائية (T cells) بأنها عالية الحركة، ونتيجة لذلك، فإن التصوير المتسلسل لقناتي TCR وGFP يؤدي إلى عدم تطابق الصورتين تماماً بسبب حركة العناقيد الدقيقة لـ TCR والخلايا.

للتغلب على هذه المشكلة، قمنا بتطوير مجهر تيرف (turf microscope) ذو قناة مزدوجة للاكتساب المتزامن.