التصوير المتعدد الوسائط من زرع الخلايا الجذعية في الجهاز العصبي المركزي من الفئران

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحقيق متابعة معيارية للسلوك الحي (in vivo) للخلايا الجذعية المزروعة في دماغ الفأر. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق وسم الخلايا السدوية المشتقة من نخاع العظم، والتي تعبر بشكل مشترك عن EGFP واللوسيفيراز، باستخدام جزيئات أكسيد الحديد الفلورية ذات الحجم الميكروني. والخطوة الثانية هي حقن الخلايا الجذعية لنخاع العظم (BMCs) الموسومة بـ MPIO بشكل مناسب في نسيج دماغ الفأر.

بعد ذلك، يتم تتبع بقاء وتمركز الطعوم الخلوية بشكل غير باضع باستخدام التصوير بالتلألؤ الحيوي والتصوير بالرنين المغناطيسي. وتتمثل الخطوة النهائية في التحقق من نتائج التصوير داخل الجسم الحي باستخدام التحليل النسيجي بعد الوفاة. يمكن لهذه الطرق أن توفر رؤية واضحة حول سلوك الخلايا الجذعية بعد زرعها في دماغ الفأر، كما يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى مثل الكائنات النموذجية ودراسات الأمراض.

يُعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن خطوات التعامل مع الحيوانات يصعب تعلمها، نظراً لصعوبة إجراء الحقن الوريدي والحقن داخل الدماغ وما ينطوي عليه ذلك من مخاطر معينة تؤثر على بقاء الحيوان. لبدء هذا الإجراء، أضف 75 × 10⁶ من جزيئات أكسيد الحديد ذات الحجم الميكروني وباللون الأزرق الجليدي إلى مزرعة خلوية نامية غير متلاصقة. قم بحضنها لمدة 16 ساعة إضافية للسماح بامتصاص الجزيئات عبر عملية الالتقام الخلوي، ثم اغسل الجزيئات المتبقية.

اترك الخلايا لتنمو لمدة 24 ساعة إضافية للحصول على تلاقي خلوي وتوزيع متجانس لـ G-B-M-P-I-O. بعد ذلك، استخدم المجهر الفلوري للتحقق بصرياً من امتصاص الجسيمات عن طريق حساب نسبة الخلايا الموجبة لـ EGFP والموجبة لـ G-B-M-P-I-O إلى العدد الإجمالي للخلايا الموجبة لـ EGFP. بعد ذلك، اغسل خلايا BMSC luciferase EGFP المميَّزة بـ G-B-M-P-I-O مرتين باستخدام 10 milliliters.

يتم معالجة الخلايا بـ tripsin EDTA في محلول PBS ثم حصادها بعد ذلك. تُغسل الخلايا بعد ذلك وتُعلق بتركيز نهائي قدره 133 × 10⁶ خلية/مل في محلول PBS. وأخيرًا، تُحفظ الخلايا على الثلج حتى وقت الزرع.

في هذا الإجراء، يتم تخدير الفأر عن طريق الحقن داخل الصفاق بخليط من ketamine بجرعة 80 milligrams per kilogram و xylazine بجرعة 16 milligrams per kilogram. انتظر لمدة خمس دقائق حتى يغط الفأر في النوم، ثم قم بحلاقة رأسه للسماح بإجراء عمليات تعقيم. بعد ذلك، ضع الفأر في إطار التوجيه المجسم (stereotactic frame)، وقم بتطهير الجلد باستخدام الكحول.

بعد ذلك، ضع مرهمًا في عيني الحيوان لمنع الجفاف. قم بإجراء شق في خط منتصف فروة الرأس لكشف الجمجمة من أجل استهداف الحصين. استخدم مثقاب الأسنان لحفر ثقب في الجمجمة على بعد 2 mm خلفيًا و 2 mm جانبيًا.

في هذه المرحلة، قم برج معلق الخلايا باستخدام جهاز المرج (vortex) لفترة وجيزة، ثم اسحب معلق الخلايا في المحقنة. بعد ذلك، اخفض إبرة المحقنة إلى عمق 2.5 millimeters تحت الأم الجافية واترك الضغط يتوازن لمدة دقيقة واحدة. وبعد مرور دقيقة، اسحب الإبرة إلى موضع يبلغ 2 millimeters تحت الأم الجافية.

ثم يتم حقن 3 µL من معلق الخلايا باستخدام مضخة حقن مجهري مؤتمنة بسرعة 0.70 µL/min. بعد الحقن، انتظر لمدة خمس دقائق إضافية لمنع التدفق العكسي لمعلق الخلايا المحقون. بعد ذلك، اسحب الإبرة ببطء.

بعد ذلك، قم بتطهير حواف الجلد، ثم قم بخياطته. احقن 300 µL من محلول sodium chloride بتركيز 0.9% تحت الجلد لمنع الجفاف. وفي النهاية، ضع الفأر تحت مصباح تدفئة للسماح له بالتعافي من التخدير لإجراء التصوير بالتلألؤ البيولوجي.

قم بتخدير الفأر باستخدام خليط من 3% isoflurane والأكسجين. ثم ضع الفأر في جهاز التصوير الفوتوني. قلل مستوى التخدير من خلال ضبط isoflurane إلى 1.5%. بعد ذلك، احقن d Lucifer وريدياً بجرعة 150 mg/kg من وزن الجسم.

قم بالتقاط الصور لمدة خمس دقائق باستخدام برنامج photo vision. بعد ذلك، قم بإجراء معالجة الصور باستخدام برنامج M three vision وقم بقياس الإشارة المرصودة باستخدام مناطق اهتمام محددة. لإجراء التصوير بالرنين المغناطيسي، قم بتخدير الفأر باستخدام 3% ISO fluorine في خليط من الأكسجين وأكسيد النيتريك.

ثم ضع الفأر في جهاز التثبيت الخاص بنظام الرنين المغناطيسي الأفقي بقوة 9.4 Tesla. خفف مستوى التخدير عن طريق ضبط نسبة isof fluorine إلى 1%. بعد ذلك، ضع مرهمًا على عيني الفأر لمنع الجفاف. ثم استخدم مسبارًا شرجيًا لمراقبة درجة حرارة الجسم.

ثم ضع مستشعراً أسفل بطن الفأر لمراقبة معدل التنفس. حافظ على معدل التنفس عند 110 ± 10 مرة في الدقيقة، وأبقِ درجة حرارة الجسم ثابتة ضمن نطاق ضيق يبلغ 37 ± 0.5 درجة Celsius. بعد ذلك، ضع ملف RF السطحي فوق رأس الفأر.

ضع الفأر في منتصف المغناطيس. بعد ذلك، افتح برنامج ParaVision 5.1، وقم بضبط معاملات التسلسل وفقاً للمخطوطة المرفقة. ثم قم بالحصول على مجموعة من 10 صور إكليلية بوزن T2 باستخدام صدى الدوران (spin echo) من أجل الحصول على معلومات تشريحية محددة.

التقط صور صدى متدرج موزونة بنجمتين (two star weighted gradient echo images) لدراسة هجرة الخلايا الجذعية بدقة مستوية تبلغ 70 micrometers squared. في هذه الخطوة، يتم تضحية الفأر واستئصال الدماغ. ثم يتم تثبيت أنسجة الدماغ في درجة حرارة الغرفة باستخدام 4%paraldehyde في PBS لمدة ساعتين.

بعد مرور ساعتين، يتم تجفيف أنسجة الدماغ عن طريق وضعها في تدرجات مختلفة من السكروز عند درجة حرارة 4 °C. وفي اليوم التالي، يتم تجميد أنسجة الدماغ باستخدام النيتروجين السائل وتخزين الأنسجة عند درجة حرارة -80 °C حتى يحين موعد التقطيع.

قم بتقطيع نسيج الدماغ إلى قطاعات بسمك 10 micrometer باستخدام المقطاع بالتجميد (cryostat). بعد ذلك، استخدم المجهر الفلوري لفحص القطاعات المجمدة غير المصبوغة بحثاً عن الفلورة الزرقاء الناتجة عن جزيئات G-B-M-P-I-O والفلورة الخضراء الناتجة عن الخلايا التي تعبر عن EGFP. ثم افحص القطاعات المجمدة غير المصبوغة بحثاً عن الفلورة الخلفية ذات اللون الأخضر والأحمر الناتجة عن الخلايا الالتهابية.

تؤدي إجراءات وسم MPIO باللون الأزرق الجليدي الموصوفة إلى وسم عالي الكفاءة لـ BMSC وخلايا luciferase EGFP، وهو ما يمكن التحقق منه بسهولة بواسطة المجهر الفلوري. بعد ذلك، عند تطعيم G-B-M-P-I-O، وخلايا BMSC الموُسمة، وخلايا luciferase EGFP في الجهاز العصبي المركزي للفئران، يمكن مراقبة بقاء الطعم الخلوي عن طريق التصوير بالتلألؤ البيولوجي في الجسم الحي بناءً على نشاط luciferase. بالإضافة إلى ذلك، يمكن مراقبة التموضع الدقيق للخلايا المطعمة عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي في الجسم الحي بناءً على محتوى الحديد في MPIO الأزرق الجليدي.

وأخيرًا، يُظهر التحليل النسيجي التحقق من صحة النتائج التي تم الحصول عليها من خلال التصوير بالتألق الحيوي والتصوير بالرنين المغناطيسي. وقد تم تأكيد البقاء المستقر من خلال تعبير مستقر لبروتين EGFP بمرور الوقت بعد تطويره. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التصوير الجزيئي لاستكشاف الأحداث الخلوية والجزيئية بعد زراعة الخلايا الجذعية في نماذج حيوانية مختلفة للأمراض التنكسية العصبية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء التصوير الجزيئي، مع تطبيق التصوير بالتلألؤ البيولوجي والتصوير بالرنين المغناطيسي، والتحقق من صحة النتائج في الجسم الحي بشكل كافٍ باستخدام التقييم النسيجي بعد الوفاة.