الفلورسنت وصفها الوراء يسمح لخارج الخلية المستهدفة واحدة وحدة التسجيل من الخلايا العصبية التي تم تحديدها

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسجيل استجابات الوحدة المنفردة داخل الجسم الحي من مجموعة محددة من العصبونات في نظام نموذجي غير جيني. ويتم تحقيق ذلك من خلال إجراء عملية فتح الجمجمة أولاً للكشف عن منطقة الدماغ المستهدفة. وتتمثل الخطوة الثانية في استخدام أسلاك التنجستن لوضع الصبغة الفلورية في المنطقة التي تبرز إليها العصبونات المستهدفة.

بعد ذلك، يتم نقل الصبغة بشكل تراجعي، مما يؤدي إلى وسم انتقائي للعصبونات الإسقاطية. وتتمثل الخطوة النهائية في التسجيل من المحور العصبي الموُسم للعصبون الإسقاطي الفردي. وفي النهاية، تُستخدم تسجيلات خارج الخلية للوحدة الواحدة لإظهار كيفية استجابة العصبونات الحسية المركزية في دائرة سليمة للتحفيز الحسي في evo.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية تتعلق بكيفية اكتشاف الدوائر العصبية للفروق التي تقل عن الملي ثانية في توقيت المدخلات التشابكية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في القدرة على استهداف عصبونات فردية أو حتى محاور عصبية وأنظمة غير قابلة للوصول إليها جينياً. وتستخدم الأسماك الكهربائية الضعيفة الإشارات الكهربائية للتواصل والملاحة.

وهم يميزون الإشارات الصادرة عن أسماك مختلفة باستخدام فروق زمنية تقل عن الميلي ثانية في توقيت المدخلات التشابكية. وقد بحثنا في كيفية تمكن العصبونات التي يُفترض أنها تعمل كمقارن زمني في دارتهم الحسية الكهربائية من اكتشاف مثل هذه الفروق الزمنية الصغيرة. ويمكن أيضاً تطبيق هذه التقنية على أنظمة أخرى مثل المسارات الحسية البصرية والسمعية.

يصعب بشكل خاص سحب السوائل من هذه الخلايا بسبب صغر حجمها وتداخلها الكثيف مع الأنسجة المحيطة والنهايات قبل التشابكية التي تغطي معظم جسم الخلية. يتيح حقن الصبغة داخل الخلايا أثناء تسجيل الخلية الكاملة في المختبر (In vitro) تحديد خلية واحدة لتوجيه التسجيلات المستهدفة من ذلك المحوار. وبالمثل، يوفر النقل الراجع بعد حقن الصبغة خارج الخلية وسيلة لوسم العصبونات الإسقاطية في مناطق الدماغ السطحية بشكل انتقائي.

يمكن استخدام ذلك لتوفير إرشادات بصرية لتسجيلات الوحدة المفردة في الجسم الحي. ولتحضير الإبرة المشفرة بـ D، قم أولاً بشحذ سلك تنغستن بقطر 160 ميكرومتر كهربائياً ليصل قطر طرف الإبرة النهائي إلى ما بين 5 و 50 ميكرومتر. ثم في الليلة التي تسبق التجربة، قم بتشفير طرف الإبرة باستخدام محلول بتركيز 2 ملي مولار من صبغة Alexa floor المقترنة بديكستران بوزن جزيئي 10,000 لغرض تحريض التخدير العام.

ضع الأسماك في مياه الحوض التي تحتوي على محلول MS 2 22 بتركيز 300 milligrams per liter، ثم قم بتثبيت الأسماك وإسكاتها كهربائياً عن طريق حقن 100 microliters من flail بتركيز 3 milligrams per milliliter في العضلات الظهرية للجسم. بعد ذلك، املأ غرفة التسجيل بمياه الحوض وضع السمكة بحيث يكون الجانب البطني للأسفل على المنصة الموجودة في مركز الغرفة. ثم قم بإيصال محلول MS 2 22 المهوى بتركيز 100 milligrams per liter بمعدل 1 to 2 milliliters per minute عن طريق وضع طرف الماصة في فم السمكة.

بعد ذلك، قم بتثبيت السمكة باستخدام قضبان ثابتة وشمع على جانبي الجسم. راقب الحالة الصحية للسمكة من خلال التحقق من التدفق المستمر للدم في الأوعية الدموية العينية ولون الجسم الطبيعي. ثم قم بتدوير المنصة على طول المحور الرأسي.

قم بضبط أحد طرفي المنصة بحيث يكون أحد جانبي السطح الظهري لرأس السمكة مكشوفاً فوق الماء، بينما يظل باقي جسم السمكة مغموراً. ضع قطعة صغيرة من مناديل Kim wipe على أي جزء غير مغمور من الجلد لمنع الجفاف. في هذا الإجراء، ضع lidocaine بتركيز 0.4% على السطح المكشوف من الرأس باستخدام مسحة قطنية Q-tip.

بعد ذلك، استخدم شفرة مشرط لقص قطعة مستطيلة من نسيج الجلد تبلغ حوالي ثلاثة مليمترات في خمسة مليمترات لسمكة يبلغ طولها 6.2 سنتيمتر. يجب أن تتماشى الحافة الجانبية للمستطيل مع مركز العين، وأن تكون الحافة الأمامية للمستطيل خلف العين مباشرة، بينما تكون الحافة الإنسية للمستطيل جانبية بالنسبة للخط المتوسط مباشرة.

بعد ذلك، قم بإزالة المستطيل باستخدام ملقط. اقطع مربعاً إضافياً بمقاس 2.5 مليمتر أمامياً للكشف عن الجمجمة. قم بتنظيف السطح المكشوف من الجمجمة تماماً عن طريق كشط أي أنسجة زائدة باستخدام شفرة المشرط.

بعد ذلك، جفف السطح تماماً باستخدام منديل Kim وهواء مضغوط. تالياً، قم بلصق وتثبيت عمود معدني في المنطقة المكشوفة من الجزء الإنسي الأمامي للجمجمة باستخدام الغراء السريع. انتظر حتى يجف الغراء تماماً.

استخدم مثقاب أسنان مزوداً برأس كربيدي كروي بقطر 0.5 millimeter لرسم مستطيل تبلغ أبعاده حوالي اثنين millimeter في أربعة millimeter على جمجمة سمكة يبلغ طولها 6.2 centimeter. بعد ذلك، قم بقص محيط المستطيل باستخدام المشرط والملاقط. ثم قم بإزالة الجمجمة.

لكشف الدماغ، قم بقص كل من الأم الجافية المصبوغة والأم الحنون الشفافة باستخدام مقص زنبركي أو إبرة. ثم قم بإزالة الأجزاء المقطوعة باستخدام ملقط لكشف النواة الجانبية الخارجية الأمامية والنواة الجانبية الخارجية الخلفية. الآن، ضع ذراع التحكم المزود بإبرة مغلفة بـ D والتي تم تحضيرها مسبقاً فوق المنطقة المستهدفة التي تحتوي على المحاور العصبية محل الاهتمام.

في حالتنا هذه، يتم إدخال الإبرة بسرعة في النواة الجانبية الخارجية الخلفية بعمق 25 micrometers تقريباً داخل النسيج. بعد انتشار الصبغة لمدة تتراوح من 15 إلى 30 ثانية، يتم سحب الإبرة. تكرر هذه العملية باستخدام إبر جديدة إضافية حسب الحاجة.

ضع كل واحدة في موقع مختلف بحيث يتم توزيع الصبغة في جميع أنحاء المنطقة المستهدفة. بعد ذلك، اشطف الصبغة الزائدة من التجويف باستخدام محلول رينجر هيكمان (hickman's ringer solution)، وانتظر لمدة ساعتين على الأقل لإتمام عملية امتصاص الصبغة ونقلها. ولتصوير المحاوير المطلوبة، ضع غرفة التسجيل التي تحتوي على السمكة تحت عدسة مجهر فلوري فوقي (epi fluorescence microscope) ثابت المرحلة وقائم.

قم بتغيير محلول التنفس إلى مياه حوض نقية مع الحفاظ على نفس معدل التدفق. ثم ضع أحد طرفي السلك الأرضي في تجويف الدماغ المكشوف وقم بتوصيل الطرف الآخر بالأرضي الخاص بمرحلة رأس التسجيل. بعد ذلك، ضع زوجاً من أقطاب التسجيل بجانب قاعدة الذيل.

بعد ذلك، قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بمضخم تفاضلي وجهاز تسجيل. ومن أجل مراقبة أمر تفريغ العضو الكهربائي (EODC)، قم بإعداد رسم تخطيطي بمقياس رسم لمنطقة الدماغ التي تمت رؤيتها بتكبير منخفض، مع تضمين الأوعية الدموية الرئيسية كعلامات استدلالية لتحديد الموقع الدقيق للمحاور العصبية الموصومة. وللتأكد من وضع D أولاً، قم بمعاينة النسيج بأكمله باستخدام إضاءة المجال الساطع للتوجيه.

ثم قم بفحصها باستخدام الإضاءة الفلورية. يجب أن تظهر النواة الجانبية الخارجية الخلفية وسماً منتشراً. بعد ذلك، وتحت تكبير عالٍ، حدد موقع النواة الجانبية الخارجية الأمامية باستخدام الأوعية الدموية كعلامات استدلالية.

قم بإضاءتها بضوء فلوري أثناء البحث عن محور عصبي مُعلم بالقرب من السطح، باستخدام أنبوب شعري زجاجي من السيليكات بقطر خارجي 1 mm وقطر داخلي 0.58 mm مع خيط سحب. اسحب قطب تسجيل ذو ساق ضيقة بطول 5 mm وقطر طرف يتراوح بين 1 إلى 2.4 µm تقريباً.

املأ القطب بمحلول رينجر هيكمان المفلتر. يجب أن تكون مقاومة الطرف النهائية في نطاق يتراوح من 16 إلى 155 mega ohms. ضع القطب في حامل أقطاب مزود بمنفذ ضغط.

قم بتوصيله بالمرحلة الرأسية المثبتة على جهاز المناولة. ثم قم بتوصيل المرحلة الرأسية بمضخم الإشارة. ويقوم جهاز استحصال تماثلي رقمي (غير موضح في الشكل) بتوصيل مضخم الإشارة بالحاسوب.

بعد ذلك، يتم تطبيق ضغط موجب بمقدار 30 millibar على خط القطب الكهربائي. يتم تقديم القطب ببطء نحو المحور العصبي من سطح النسيج. وعندما يقترب القطب من المحور العصبي، يجب أن يتسبب الضغط الموجب في حركة طفيفة ولكن ملحوظة للمحور العصبي أثناءما يكون القطب بجواره.

سجّل النشاط أثناء تقديم محفزات الاختبار. ورغم أن وجود أثر كهربائي (electrical artifact) يؤكد صحة التسجيل والتحفيز، إلا أنه يجب ألا تظهر جهود فعل (action potentials). حرّر الضغط الخارجي في القطب الكهربائي وكرر عملية التحفيز والتسجيل.

ثم قم بتطبيق شفط خفيف يؤدي إلى تحرك المحور العصبي داخل القطب الكهربائي. كرر عملية التحفيز والتسجيل مرة أخرى. الآن، يجب أن تظهر بعض جهود الفعل استجابةً لعمليات التحفيز.

بمجرد ظهور جهود الفعل، أغلق خط الضغط. وعند الانتهاء من جميع التسجيلات المطلوبة، أعد تحويل مياه الخزان إلى محلول التنفس الذي يحتوي على MS 2 22 بتركيز 100 mg/L لضمان تخدير السمكة تماماً. يجب ألا يتم رصد أي EODC لمدة 10 دقائق على الأقل قبل القيام بعملية القتل الرحيم للسمكة.

تظهر هنا خمسة آثار عينة توضح جهود الفعل التي استحثها تحفيز نبضي مربع مستعرض موجب في الجانب المقابل، أحادي الطور، وبقيمة 6 millivolts per centimeter ولمدة 0.1 millisecond، وهنا يظهر مخطط راستر يوضح أوقات الومضات خلال 20 تكراراً لنافذة تسجيل مدتها 75 millisecond لنفس الوحدة التي تم تحفيزها عند الزمن صفر بتحفيزات قدرها 6 millivolts per centimeter. ومدرج على اليمين نطاق المدد الزمنية. كما يظهر هنا منحنى ضبط مدة التحفيز الذي يحدد كمية الاستجابات بعدد الومضات لكل تكرار تحفيزي.

بمجرد إتقانها، يمكن إتمام الجراحة وحقن الصبغة الموضحة في هذه التقنية في غضون ساعة واحدة إذا تم تنفيذها بشكل صحيح، ويمكن بدء التسجيلات بعد ساعتين إلى ثلاث ساعات من حقن الصبغة. وأثناء محاولة إجراء هذه العملية، من المهم تذكر مراقبة صحة الحيوان التجريبي بعناية بعد هذا الإجراء. ويمكن استخدام طرق أخرى مثل التصوير بفوتونين من أجل التسجيل من العصبونات في هياكل دماغية أكثر عمقاً.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، ينبغي أن يكون لديك فهم جيد لكيفية وسم وتسجيل استجابات الوحدة الواحدة من مجموعة محددة من الخلايا العصبية.