الكشف عن المتغيرات الجينية النادرة من تسلسل المجمعة عن طريق سبلينتر

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد الجينات ضمن مجموعة من الأفراد الذين يظهرون غلبة من التباينات الوظيفية النادرة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تجميع مجموعة من عينات DNA. وتتمثل الخطوة الثانية في إنشاء ومسح مكتبة تسلسل من الجيل التالي.

يتبع ذلك محاذاة القراءات مع التسلسل المرجعي وإنشاء نموذج للأخطاء. أما الخطوة النهائية فهي التحليل الحسابي باستخدام خوارزمية splinter. وفي نهاية المطاف، يُستخدم تحليل splinter لتسلسل الجيل التالي المجمّع لإظهار الجينات داخل المجموعات التي تحتوي على وفرة من التباين الوظيفي النادر، مما يوضح الإجراء المتبع.

سيكون معنا اليوم فرانشيسكو فيلانيا، وهو طالب دراسات عليا في مختبر معلمي ومعاوننا روب ميترا، وسينضم إليه إنريكي راموس، وهو طالب دراسات عليا في مختبري. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الأنماط الجينية للفرد الواحد، في أنها تتيح الكشف بدقة عالية عن متغيرات التسلسل النادرة في مجتمع مختلط من جزيئات DNA دون الحاجة إلى أي معلومات مسبقة. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجالات الوراثة وعلم الجينوم، مثل كيفية تحديد تردد المتغيرات النادرة الجديدة المسببة للأمراض في دراسات المجموعات الكبيرة.

تتطلب كل تجربة لتقسيم القطع (splinter experiment) وجود ضابط سلبي وضابط إيجابي للحصول على الدقة المثلى، قم بتحضير مزيج تفاعل PCR باستخدام PFU ultra high fidelity DNA polymerase. الضابط السلبي هو ناتج PCR من أي تسلسل DNA معروف بخلوه من التباين الوراثي، مثل العمود الفقري لناقل مستنسخ (cloned vector backbone).

هنا، يتم استخدام مضخم (amplicon) يتكون من 1,934 زوجاً قاعدياً من ناقل M 13 MP 18. يمكن أن تكون الضابطة الموجبة أي مجموعة من متغيرات التسلسل التي تم التحقق من صحتها مسبقاً والموجودة في كامل المجتمع. وفي حال عدم توفر هذه البيانات، صمم هذا المختبر ضابطة موجبة اصطناعية تتكون من ناتج PCR بطول 331 زوجاً قاعدياً من مزيج من تسلسلات مُهندسة تم استنساخها في ناقل PGMT easy كما هو موضح في هذا الجدول.

يتم دمج هذه التسلسلات لمحاكاة ترددات مختلفة للأليلات الثانوية للمتغيرات الحقيقية ضمن مجموعة المرضى. بعد تضخيم العينات بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المرفق بهذا الفيديو، يتم تنظيف كل ناتج PCR من البادئات الزائدة باستخدام أعمدة التنقية Kyogen Kayak Quick Column، أو أطباق الترشيح ذات 96 بئراً مع مجمع تفريغ لعمليات التنظيف واسعة النطاق. وبمجرد التنقية، يتم تحديد كمية كل ناتج PCR باستخدام التقنيات القياسية.

استعد لدمج جميع نواتج PCR والعينات الضابطة في تجمع موحد بناءً على عدد الجزيئات. سيؤدي التجميع بناءً على التركيز إلى تمثيل مفرط لقطع التضخيم الصغيرة مقارنة بالنواتج الأكبر حجمًا. وبدلاً من ذلك، قم بتجميع عدد موحد من الجزيئات لكل قطعة تضخيم.

اختر أرقاماً عشوائية تكون كبيرة بما يكفي للحفاظ على الدقة أثناء عملية السحب بالماصة. اسحب نواتج PCR والضوابط. يعد ربط نواتج PCR ضرورياً لأن تكسير قطع PCR الصغيرة سيؤدي على الأرجح إلى تحيز التمثيل نحو نهاياتها.

لهذا السبب، نقوم بربط نواتج PCR المستخلصة في ناقل كبير قبل تجزئتها. قم بتحضير خليط الربط للنهايات غير اللزجة باستخدام T four Ligase و T four PNK و PEG كما هو موضح في البروتوكول. يتم تحضين التفاعل عند 22 degrees Celsius لمدة 17 ساعة.

يتبع ذلك التحضين عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، ثم الحفظ عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك، يتم التحقق من عملية الربط عن طريق تحميل 50 nanograms من العينة في هلام أغاروز. سيؤدي الربط الناجح إلى ظهور حزمة ذات وزن جزيئي مرتفع في المسار.

قم بالتحضير لتجزئة DNA من خلال استراتيجية سونيكيشن عشوائية عن طريق تخفيف العينة بنسبة 10 إلى 1 في محلول Qiagen PB Buffer لتقليل لزوجتها. بعد ذلك، قم بتجزئة التراكيز العالية من نواتج PCR باستخدام جهاز Diagen Node Bio Rupture بسعة 24 عينة، وقم بإجراء السونيكيشن بقوة عالية على مدار 25 دقيقة، مع تشغيل الجهاز لمدة 40 ثانية وإيقافه لمدة 20 ثانية في كل دقيقة. تحقق من نتائج تجزئة DNA باستخدام agarose gel، ثم تابع بعملية تسلسل Illumina كما هو موضح في النص.

لبدء تسلسل القراءات ومحاذاتها، قم إما بتحويل ملفات تسلسل القراءات الخام إلى صيغة scarf، أو قم بضغطها. عملية الضغط اختيارية.

يساهم ذلك في توفير الوقت والمساحة لخطوات التحليل اللاحقة دون فقدان أي معلومات ذات صلة. وباستخدام أداة المحاذاة المرفقة، قم بمحاذاة القراءات الخام مع التسلسل المرجعي الموصوف الأسرع. وتشمل المناطق المستهدفة تفاعلات PCR بالإضافة إلى الضوابط الموجبة والسالبة.

يجب أن يكون تنسيق الإدخال بتنسيق scarf أو مضغوطاً. بعد ذلك، قم بإجراء وسم الملفات كما هو موضح في النص. تولد كل عملية تشغيل ملفاً تعريفياً فريداً لأخطاء التسلسل، والذي يجب توصيفه من أجل تحديد دقيق للمتغيرات لنمذجة الأخطاء لكل عملية تشغيل.

يتم إدراج ضابط داخلي معروف بتنوع تسلسله في كل مكتبة عينات مجمعة من الملف الموائم والموسوم. قم بإنشاء ملف لنموذج الخطأ باستخدام الأداة المرفقة مع التسلسل المرجعي للضابط السلبي، حيث يمكن استخدام جميع تسلسلات الضابط السلبي أو بدلاً من ذلك استخدام مجموعة فرعية فقط عند تحديد نهاياتها من الطرف '5 والطرف '3. يجب دائماً تطبيق القراءات الفريدة والعدادات الوهمية.

ستقوم الأداة بإنشاء ثلاثة ملفات تحمل اسم معلمة ملف المخرجات وتنتهي بالأرقام صفر أو واحد أو اثنين. وتتوافق هذه الملفات على التوالي مع نموذج خطأ من الدرجة صفر والأولى والثانية لاستدعاء المتغيرات باستخدام splinter. ويجب دائمًا استخدام نموذج الخطأ من الدرجة الثانية لتصور ملف معدل خطأ التشغيل.

يمكن استخدام نص Pearl البرمجي المستخدم لرسم مخطط نموذج الخطأ لتوليد مخطط خطأ بصيغة PDF لملف نموذج الخطأ من الرتبة الصفرية. وسيكشف ملف المخطط عن اتجاهات الخطأ الخاصة بكل عملية تشغيل، ويمكن استخدامه لاستنتاج الحد الأقصى لعدد القواعد المقروءة للتحليل. سيوضح القسم التالي كيفية تشغيل splinter على الملف المحاذى باستخدام نموذج الخطأ للكشف عن متغيرات التسلسل النادرة.

تتمثل الخطوة الأولى في التحليل في تشغيل برنامج splinter على الملف المحاذي باستخدام التسلسل المرجعي ونموذج الخطأ. ويمكن استبعاد القواعد في القراءات الفردية من التحليل إذا تبين أنها معيبة. وتحدد قيمة القطع لـ P-value مدى صرامة تحليل استدعاء المتغيرات.

تعتبر قيمة الحد الأدنى المقطعية -1.301 نقطة بداية جيدة. يعمل خيار حجم التجميع (pool size) على تحسين تمييز إشارة الخوارزمية مقابل الضوضاء من خلال استبعاد التباين المحتمل المرتبط بتكرارات الأليلات الثانوية التي تكون أقل من تكرار أليل واحد في التجميع الفعلي. يجب ضبط خيار حجم التجميع على أقرب قيمة تكون أكبر من العدد الفعلي للأليلات التي تم تحليلها في التجربة.

سيتم تجاهل التباينات التي تظهر بترددات منخفضة باعتبارها ضجيجاً. بعد إدخال جميع المعلمات وأسماء الملفات، قم بتشغيل برنامج splinter. يعيد هذا الملف جميع النتائج ذات الدلالة الإحصائية عبر العينة، مع وصف لموقع التباين ونوعه.

قيمة P لكل تردد لخيط DNA للمتغير وإجمالي التغطية لكل خيط DNA. تُستخدم قائمة القوارير بواسطة برنامج splinter لتوحيد التغطية عبر العينة. يشير الحقل الأول إلى قطعة الأمبليكون المستهدفة، بينما يشير الحقل الثاني إلى الموضع الذي توجد فيه الطفرة.

يشير الرمز N إلى أن بقية التسلسل لا تحتوي على أي طفرة. يُعد تحليل الضابط الموجب أثناء عملية التطبيع (Normalization) أمرًا أساسيًا لزيادة الحساسية والنوعية في تشغيل محدد. وهذا أمر مهم لأن القيمة الحدية الأولية البالغة -1.301 لن تكون كافية على الأرجح لاستبعاد جميع النتائج الإيجابية الكاذبة.

سيُظهر كل تحليل لشظايا الحمض النووي (splinter analysis) قيمة P-value الفعلية لكل متغير تم تحديده، والتي لم يكن من الممكن التنبؤ بها مسبقاً كأولوية. ومع ذلك، يمكن تكرار التحليل بالكامل باستخدام أقل قيمة P-value صرامة ظهرت في المخرجات الأولية لمواقع القواعد التي ثبتت إيجابيتها الحقيقية. سيعمل هذا الإجراء على الاحتفاظ بجميع النتائج الإيجابية الحقيقية مع استبعاد معظم النتائج الإيجابية الكاذبة، إن لم يكن جميعها، والتي عادةً ما تكون قيم P-value الخاصة بها أقل أهمية بكثير مقارنة بالنتائج الإيجابية الحقيقية.

لأتمتة هذه العملية، يمكن استخدام نص "cutoff tester" البرمجي. يتطلب هذا النص ملف مخرجات splinter وقائمة من نتائج الضبط الموجبة في شكل ملف مفصول بعلامات جدولة، مثل الملف المستخدم في عملية التسوية. ستكون المخرجات الناتجة عبارة عن قائمة من قيم القطع (cutoffs) التي تصل تدريجياً إلى القيمة المثلى.

يمثل الخط الأخير الحد الفاصل الأكثر مثالية لهذه التشغيلة، وبالتالي يمكن استخدامه في تحليل البيانات. والنتيجة المثالية هي تحقيق حساسية ونوعية تبلغ واحد. ومع ذلك، في حال عدم الوصول إلى ذلك، يمكن تحسين تحليل الشظايا عن طريق تغيير عدد قواعد القراءة المدمجة.

يمكن تطبيق حد القطع النهائي على البيانات باستخدام سكربت cutoff cut، والذي سيعمل على تصفية ملف مخرجات splinter من الإصابات التي تقل عن حد القطع الأمثل. ستؤدي هذه الخطوة إلى إنشاء ملف مخرجات splinter النهائي، والذي سيحتوي على الـ snips والـ indels الموجودة في العينة. يرجى ملاحظة أن مخرجات عمليات الإقحام تختلف قليلاً عن مخرجات عمليات الاستبدال أو الحذف.

يتم تصور الدقة كدالة للتغطية لأليل واحد في عينة مجمعة في هذا النوع من المخططات. تُقدر الدقة على أنها المساحة تحت المنحنى، والتي تُختصر بـ a UC لمنحنى خصائص تشغيل المستقبل، وتتراوح من دقة عشوائية تبلغ 0.5 إلى دقة مثالية تبلغ 1.0. في هذا المثال، يتم رسم a UC كدالة للتغطية لكل أليل للكشف عن الأليلات الطافرة الفردية في مجموعات تتراوح من 200 إلى 501، و1,000 أليل.

هنا يتم رسم منحنى UC كدالة للمجموع الكلي للإدراجات، والحذوفات، والاستبدالات. يوضح مخطط الخطأ هذا احتمالية دمج قاعدة خاطئة في موضع معين. ويظهر ملف الخطأ معدلات خطأ منخفضة مع اتجاه تصاعدي نحو النهاية الثلاثية (3') لقراءة التسلسل.

تُظهر النيوكليوتيدات المرجعية المختلفة بشكل ملحوظ احتمالات خطأ متفاوتة. يوضح هذا المخطط دقة أداة splinter في تقدير تردد الأليل للمواقع التي كانت تغطيتها أكبر من 25 ضعفًا لكل أليل. مقارنة بين ترددات أليلات الحمض النووي (DNA) المجمعة والمقدرة بواسطة splinter مع أعداد الأليلات المقاسة من خلال دراسات الارتباط الجينومي الواسع أو نتائج GWAS.

في ارتباط عالٍ جداً، تم سحب مجتمع يتكون من 974 فرداً واستهداف منطقة تزيد عن 20 kilobases للتسلسل. تم تطبيق Splinter للكشف عن المتغيرات النادرة. ووفقاً للبروتوكول القياسي، خضع كل فرد مسبقاً للتنميط الجيني من خلال مطابقة gwas بين التنميط الجيني للمتغيرات المحددة والمتغيرات الجديدة.

كانت نتائج تحديد المتغيرات في العينة المجمعة ممتازة. تم تحديد ثلاثة متغيرات من نتائج التسلسل، اثنان منها كانا نادرين في المجتمع، وتم التحقق من صحتها عن طريق تسلسل بايرو الفردي، وكانت ترددات الأليل الثانوية أو التطابق الحسابي بين تسلسل بايرو والتسلسل المجمّع ممتازة. وبمجرد انتهائك من العثور على المتغير النادر في عينتك المجمعة، يرغب الكثيرون في معرفة التبعات الوظيفية للمتغير الذي تم تحديده.

وبذلك تصبح عملية توصيف التباين الخاص بك هي الخطوة التالية في العملية بعد مرحلة التطوير. لقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تسلسل الحمض النووي DNA لدراسة المتغيرات النادرة بطريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة لتوصيف المتغيرات النادرة في دراسات المجموعات السكانية الكبيرة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الكشف عن متغيرات التسلسل النادرة في عينة مجمعة من DNA باستخدام splinter.