Endothelialized على microfluidics لدراسة التفاعلات الاوعية الدموية الدقيقة في الأمراض الدموية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء جهاز ميكروفلويديك (microfluidic device) مغطى بالخلايا البطانية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تصنيع قالب الميكروفلويديك، ثم تتمثل الخطوة الثانية في إنشاء قناة PDMS.

بعد ذلك، يتم استزراع الخلايا البطانية داخل الجهاز. وتتمثل الخطوة النهائية في تنمية الخلايا داخل الجهاز. وفي النهاية، تُستخدم الأجهزة الموائع مجهرية المكسوة بالخلايا البطانية لإظهار التفاعلات بين الخلايا في المختبر.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في أنها تمنح الباحث تحكماً دقيقاً في الظروف البيولوجية والبيوفيزيائية، كما أنها متوافقة مع المجهر الفلوري. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول التفاعلات البيوفيزيائية بين الخلايا في الأمراض الدموية، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على ظواهر أخرى مثل بيولوجيا الكريات البيضاء، وانتشار السرطان، وبيولوجيا الخلايا الجذعية المكونة للدم. وبشكل عام، قد يواجه المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن الظروف يجب أن يتم التحكم فيها بدقة لضمان استقرار الخلايا بنجاح.

كجزء من التحضير للتصنيع، يتم إنشاء قناع ضوئي عن طريق إرسال صورة تصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) لجهاز الموائع الدقيقة إلى مورد أقنعة خارجي. يتكون القناع عند استلامه من طبقة من الكروم على زجاج الصودا والجير. يبلغ عرض قناة الموائع الدقيقة هنا 30 microns.

لبدء تصنيع الجهاز الموائع الدقيقة، يتم تنظيف رقاقة سيليكون عارية باستخدام محلول بيرانا لمدة 15 دقيقة، ثم شطفها بالماء منزوع الأيونات لمدة 10 ثوانٍ. بعد ذلك، تُغمر رقاقة السيليكون في حمض الهيدروفلوريك لمدة 30 ثانية، وتُشطف بالماء منزوع الأيونات لمدة 10 ثوانٍ تقريبًا. تالياً، وباستخدام جهاز الطلاء الدوراني، يتم طلاء مادة MicroChem SU-8 2025 المقاومة للضوء على الرقاقة لتصل إلى سمك 30 ميكرون وبسرعة دوران تبلغ 3000 دورة في الدقيقة.

ضع الرقاقة المطلية بـ SU 8 20 25 على لوح تسخين مضبوط عند 95 °C لمدة خمس دقائق للتخلص من المذيب الزائد. لا يُنصح باستخدام الفرن في هذه الخطوة. الآن، ضع القناع الضوئي فوق الرقاقة وعرّضها للأشعة فوق البنفسجية UV في محاذٍ للقناع لربط SU 8 20 25 المقاوم للضوء تشابكياً.

بعد عملية الربط التشابكي، ضع الرقاقة مرة أخرى على اللوح الساخن عند 95 °C لمدة خمس دقائق إضافية، وذلك لتسريع بلمرة المادة المقاومة للضوء SU 8 20 25 بشكل أكبر. بعد ذلك، اغمر الرقاقة في محلول SU eight المظهر، المكون أساساً من P-G-M-E-A، لمدة أربع دقائق.

سيعمل ذلك على إزالة مادة SU 8 20 25 المقاومة للضوء غير المتشابكة. اشطف الرقاقة التي تم تحميضها حديثاً بكحول إيزوبروبيل 100% لمدة 10 ثوانٍ، ثم جففها باستخدام النيتروجين المضغوط، أو بترك المذيب يتبخر من الرقاقة داخل خزانة استخلاص نظيفة لعدة دقائق. الآن، قم بتثبيت الرقاقة المجففة في مركز طبق بتري باستخدام شريط لاصق، مع الحرص على وضع الشريط عند حواف الرقاقة.

أخيراً، قم بنقل 500 microliters من sigma coat بواسطة الماصة إلى الرقاقة. غطِّ أطباق بتري بالغطاء، ثم قم بتدوير الطبق لضمان تغطية الرقاقة بالكامل. ارفع الغطاء واترك الرقاقة تجف لعدة دقائق حتى يتبخر كل المذيب.

بعد خلط بوليمر PDMS وعامل المعالجة بنسبة وزنية تبلغ 10 إلى 1، قم بإزالة الفقاعات الهوائية باستخدام مجفف تفريغ لمدة تتراوح من عدة دقائق إلى ساعة واحدة، وذلك حسب قوة نظام التفريغ المتاح. بعد إزالة جميع الفقاعات الهوائية، صب الخليط في الطبق بحيث يتم تغطية الرقاقة وسطح الطبق، وذلك لإنشاء طبقة من PDMS يبلغ سمكها خمسة مليمترات تقريبًا.

قم أيضاً بإنشاء قطعة رقيقة ملساء من PDMS بسمك 1 mm. ثم قم بمعالجة الخليط في فرن عند درجة حرارة 60 °C طوال الليل. وفي اليوم التالي، استخدم سكيناً أو مشرطاً للقص حول الرقاقة وإزالة عدة أجهزة ميكروفلويديك من PDMS.

بعد ذلك، قم بقص الورقة لعزل الأجهزة الفردية. قص ورقة PDMS بحيث تكون أكبر قليلاً من الجهاز الموائع دقيقية (microfluidic device). الآن استخدم مثقاب يدوي دقيق (pin vice) من نوع Harris unicorn أو جهازاً مماثلاً لعمل فتحات المداخل والمخارج في الجهاز الموائع دقيقة.

بعد ذلك، قم بتنظيف أسطح الجهاز الموائع الدقيقة والرقاقة باستخدام شريط لاصق. ثم استخدم جهاز تنظيف البلازما لتعريض أسطح الجهاز الموائع الدقيقة ورقاقة PDMS لبلازما الأكسجين لمدة 30 ثانية. وتعمل بلازما الأكسجين على تكوين أنواع تفاعلية على السطح المكشوف لـ PDMS، والتي ترتبط ببعضها عند التلامس الفيزيائي.

بعد ذلك، املأ محقنة سعة 1 مل مزودة بإبرة ذات طرف غير مدبب مقاس 20 بتركيز 50 µg/mL من Fibronectin المستخلص من البلازما البشرية في PBS، ثم قم بتركيب قطعة من الأنبوب فوق الإبرة. أدخل قطعة من أنبوب أكثر دقة داخل قطعة الأنبوب الأولى لإنشاء وصلة محكمة بالتثبيت الاحتكاكي بين قطعتي الأنبوب.

بعد ذلك، قم بتوصيل الطرف الآخر من قطعة الأنبوب الأكثر دقة بمدخل الجهاز الموائع الدقيق. اضغط على المحقنة لملء القنوات بالكامل بمحلول fibronectin وتكوين قطرة صغيرة بحجم 100 µL عند منفذ المخرج لضمان بقاء القنوات رطبة. الآن، قم بحضن الجهاز الموائع الدقيق في حاضنة رطبة عند 37 °C لمدة تتراوح من 40 إلى 60 دقيقة.

بعد انتهاء فترة الحضانة، قم بتوصيل محقنة جديدة مملوءة بـ PBS بالإبرة ذات الرأس غير المدبب. اضغط لطرد الهواء وغسل الجهاز الموائع الدقيقة بـ PBS. قم بتحضير من 500,000 إلى 2 مليون خلية لكل ملليلتر من الخلايا البطانية لوريد السرة البشري، أو hve في وسط نمو بطاني يحتوي على 8% dextran.

تزيد إضافة الدكستران من احتمالية التصاق الخلايا واستزراعها بنجاح داخل جهاز الموائع الدقيقة. املأ محقنة نظيفة مثبت بها إبرة ذات سن غير مدبب وأنبوب أوسع بمعلق الخلايا، ثم قم بتوصيل قطعة أطول من الأنبوب يبلغ طولها حوالي متر واحد. من الضروري التأكد من إحكام تركيب الأنابيب لمنع حدوث أي تسرب بين الوصلات.

قم بتجهيز الأنابيب بمحلول الخلايا، مع التأكد من عدم وجود فقاعات في المحقنة أو في أي من الأنابيب لتحسين أداء النظام. ومن الضروري في هذه المرحلة منع حدوث أي تسرب أو دخول فقاعات إلى النظام؛ إذ إن أي تسرب للمحلول أو وجود فقاعات في الوسط سيمنع الاستقرار الناجح للخلايا البطانية.

بمجرد التخلص من جميع الفقاعات وملء كامل طول الأنبوب بمعلق الخلايا، ضع المحقنة على المضخة وقم بتوصيل الطرف الآخر بمدخل الجهاز الموائع الدقيقة. يتم ضبط مضخة المحقنة بحيث تكون على نفس ارتفاع جهاز الموائع الدقيقة. يتم لف الأنبوب الطويل بعناية داخل الحاضنة لضمان تدفئة الخلايا والوسط بشكل كافٍ قبل ملامستها للجهاز.

بعد ذلك، يتم ضخ معلق الخلايا في الجهاز الموائع دقيق القنوات بمعدل تدفق حجمي قدره 1.23 microliters per minute لمدة ساعتين عند 37 °C و5% carbon dioxide في نظامنا. يتوافق معدل التدفق الحجمي البالغ 1.23 microliters per minute مع سرعة تيار وسطى قدرها 1 mm/s في أصغر القنوات. وهذا يقارب إجهاد قص جداري قدره 1 dyne/cm² في تلك القنوات عند استخدام الدم الكامل.

بمجرد اكتمال تسريب معلق الخلايا، استخدم مضخة الحقن نفسها والأنبوب الطويل مع حقنة أكبر لتسريب وسط نمو جديد لمدة تتراوح من يومين إلى ثمانية أيام بمعدل 1.23 microliters per minute. وعندما تصل الطبقة الخلوية الأحادية إلى مستوى الالتحام المطلوب، احقن الدم أو معلق الخلايا في النظام لإجراء التجربة. يظهر هنا الجهاز الموائع دقيق قبل عملية التبطين البطاني.

تم ملء الجهاز الموائع الدقيقة بملون طعام لتوضيح الحجم والمقياس والتصميم العام للجهاز الذي يحاكي فسيولوجيا الأوعية الدموية. يكشف المجهر ذو المجال المضيء عن عملية تبطين الخلايا البطانية في جهاز الموائع الدقيقة. تم التقاط هذه الصورة في غضون أقل من 48 ساعة من عملية الاستزراع باستخدام البروتوكول الموصوف، حيث تسمح تقنية التروية المُحسّنة للخلايا البطانية بتغطية كامل السطح الداخلي لنظام الموائع الدقيقة بشكل متلاحم.

خلال 24 إلى 48 ساعة من استزراع الخلايا. كما يظهر في هذه الصورة المجهرية البؤرية، فإن الورم الوعائي الدقيق على شريحة يحتوي على قنوات دقيقة يقارب حجم 30 micron للأوعية ما بعد الشعيرية، وهي الموقع الذي تحدث فيه معظم حالات الانسداد الوعائي الدقيق لفقر الدم المنجلي. في هذه التجربة، يتم ضخ دم كامل من مرضى أصحاء في جهاز أوعية دقيقة على شريحة في ظروف خالية من الأكسجين.

يوضح هذا المقطع أن تدفق الدم الكامل في نظامنا الموائع الدقيقة البطاني منتظم وسلس ومستمر دون وجود أي مناطق انسداد في القنوات الدقيقة. وهنا، يتم ضخ دم كامل من مرضى فقر الدم المنجلي في جهاز رقاقة للأوعية الدموية الدقيقة. وفي ظروف نقص الأكسجين، تظهر تغيرات ملحوظة في تدفق الدم مع وجود انسدادات كاملة في عدة قنوات.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر عدم إدخال فقاعات هواء عند تبديل الأنابيب. يتوافق الجهاز النهائي مع المجهر الفلوري ويمكن تطويعه ليتناسب مع فحوصات الفلورة التقليدية. وتمهد هذه التقنية الطريق لأخصائيي أمراض الدم التجريبية لإجراء تجارب باستخدام خلايا مفردة في بيئة بيوفيزيائية وهيموديناميكية محكومة.

بدون فقاعات.