الإذابة والحيوية، من اقتران نقاط الكم وفحوصات السمية البكتيرية التي منحنى النمو والكونت بلايت

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء فحص عالي الإنتاجية للتأثيرات المضادة للبكتيريا للجسيمات النانوية، سواء كانت مقترنة بالمضادات الحيوية أم لا. وهنا، يتم اختبار التأثيرات المضادة للبكتيريا لنقاط تيلورايد الكادميوم الكمومية المقترنة بـ poly mix وB لتحقيق ذلك. يتم أولاً إذابة النقاط الكمومية في me, capto proprionic acid.

بعد ذلك، يتم ربط النقاط الكمومية بـ poly mix، ثم تُعالج البكتيريا المزروعة في أطباق مع المضاد الحيوي B باستخدام كل من النقاط الكمومية المقترنة بالمضاد الحيوي وغير المقترنة. ويُعرّض نصف العينات لإشعاع بضوء أزرق بطول موجي 440 nanometer لمدة 30 دقيقة، مما يؤدي إلى توليد الإكسيتونات وأنواع الأكسجين التفاعلية من النقاط الكمومية لتقييم تأثير معالجات النقاط الكمومية على نمو البكتيريا وبقائها. يتم أخذ قراءات الكثافة الضوئية وإجراء تعداد للمستعمرات. وتشير البيانات الناتجة إلى أن تطبيق نقاط Telluride الكاديوم الكمومية المقترنة بالمضاد الحيوي، متبوعة بالإشعاع، يحقق أكبر تأثيرات إبادية من بين الظروف التي تم اختبارها.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية حول تأثير النقاط الكمومية من تيلوريد الكادميوم واقترانها بـ polyx in B على نمو E coli، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنواع أخرى من الجسيمات النانوية والمضادات الحيوية على سلالات بكتيرية مختلفة. وبشكل عام، قد يواجه المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات، لأن أي زيادة في MPA ستؤدي إلى تكتل النقاط الكمومية، وإذا قاموا بسحب كمية زائدة حتى ولو كانت صغيرة من toline، فإن ذلك سيؤدي إلى إتلاف المرشح.

على الرغم من أننا سنستعرض اليوم طريقة لتقييم التأثيرات المضادة للبكتيريا للنقاط الكمومية من يوديد السيلينيوم وكادميوم (KE IDE) المقترنة بالمضادات الحيوية، إلا أنه يمكن استخدام طريقة مماثلة مع أنواع أخرى من النقاط الكمومية مثل فوسفات الإنديوم، وكبريتات الزنك، وكبريتات زنك يوديد الكادميوم. ابدأ هذا الإجراء بتحضير محلول من النقاط الكمومية من تيلوريد الكادميوم أو CDTE في التولوين بتركيز 15 µM في قارورة زجاجية، ثم قم بقياس الكثافة الضوئية أو OD عن طريق مطيافية الامتصاص، وباستخدام ماصة، انقل 200 µL من هذا المحلول المركز إلى قارورة زجاجية.

تجنب استخدام البلاستيك. ثم أضف 800 µL من التولوين، و1 mL من محلول البورات المنظم بتركيز 200 mM، و2 µL من حمض MER capto proprionic أو MPA بتركيز 11.5 M؛ أغلق القارورة بإحكام ورجها بقوة لمدة تتراوح من 30 إلى 60 ثانية. بعد الرج، ستنفصل الطورين المائي والعضوي تلقائياً.

ستكتسب المرحلة المائية لون النقاط الكمومية. ولتجنب الطبقة الفاصلة، قم بإزالتها، ثم أزل مرحلة النقاط الكمومية وانقلها إلى قارورة نظيفة. ولتنقية النقاط الكمومية المذابة، انقلها إلى مرشح طرد مركزي سعة 500 µL.

أضف 100 µL من محلول bore eight المنظم بتركيز 50 mM وقم بالطرد المركزي عند 3000 ×g لمدة 13 دقيقة. كرر عملية الغسل هذه أربع مرات. بعد الغسلة الأخيرة، قم بتعليق النقاط الكمومية المغسولة في 500 µL من محلول bore المنظم، واحفظها عند درجة حرارة 4 °C.

ستظل مستقرة لمدة تتراوح من أسبوع إلى أسبوعين. لتقدير تركيز النقاط الكمومية، قم بقياس أطياف الامتصاص والانبعاث. يوضح هذا الشكل النقاط الكمومية من CDTE تحت إضاءة مصباح UV وأطياف الانبعاث قبل وبعد الإذابة في الماء، مما يظهر تغيراً طفيفاً في الخصائص البصرية نتيجة لتبادل الليجاند.

ينطبق هذا الجزء من البروتوكول على أي جسيمات نانوية مشحونة سلبًا ومُشَمِّسة مائيًا، بما في ذلك الطحالب، والنقاط الكمومية التجارية، والجزيئات المعدنية، وغيرها. في هذا المثال، سيتم ربط المضاد الحيوي poly mixen B أو PMB بالنقاط الكمومية بنسبة مولية تبلغ 30 إلى 1. يتميز PMB بشحنة موجبة ويتجمع ذاتيًا دون الحاجة إلى عملية الربط. الكواشف: يتم إذابة PMB في الماء.

بتركيز 60 micromolar. بالنسبة لصفيحة ذات 96 بئراً تحتوي على 0.3 milliliters من البكتيريا لكل بئر في أربع مكررات. فإن 0.5 milliliters من مرافق بتركيز 200 nano molar تكفي لتحضير ذلك عن طريق إضافة 100 microliters من النقاط الكمومية بتركيز one micromolar في محلول bore buffer بتركيز 50 millimolar إلى أنبوب طرد مركزي دقيق.

بعد ذلك، أضف 50 µL من محلول المضاد الحيوي PMB بتركيز 10 x أو 60 µM في الماء إلى أنبوب الاقتران. وأضف 50 µL من الماء إلى أنبوب التحكم. أكمل الحجم إلى 0.5 mL باستخدام منظم pH بتركيز 50 mM. غلف الأنابيب بورق ألومنيوم لحمايتها من الضوء، ثم ضعها على جهاز تدوير لمدة ساعة واحدة.

في حال حدوث تجمع، كرر عملية الاقتران بتركيزات أقل من المضاد الحيوي. قم بمعايرة التركيز تصاعدياً حتى لا تتجمع الجسيمات لغسل المقترنات. صب المحاليل عبر مرشح بحد قطع للوزن الجزيئي يبلغ 10,000، وهو مرشح فعال لمعظم المضادات الحيوية ولكن ليس للبروتينات أو الأجسام المضادة.

أخيراً، قم بتقدير عدد جزيئات المضاد الحيوي لكل نقطة كمية، وذلك عن طريق قياس الامتصاصية أو مطيافية الفلورة، أو الرحلان الكهربائي للهلام، أو مطيافية تحويل فوريه للأشعة تحت الحمراء. يوضح هذا الشكل أطياف الامتصاص والانبعاث النموذجية للنقاط الكمية قبل اقتران PMB، وطيف الانبعاث بعد إضافة 160 مكافئ مولاري من PMB.

تظهر هنا العلاقة بين نسبة PMB وشدة انبعاث النقاط الكمومية (المشار إليها بالمربعات) وموقع طول موجة الذروة (المشار إليه بالمثلثات). ومع زيادة تركيز PMB، تنخفض شدة انبعاث QD، مما يؤدي إلى إزاحة في طول موجة انبعاث الذروة. ويتم تنفيذ الجزء التالي من البروتوكول لتحديد التركيز المثبط لنصف القيمة القصوى أو IC 50 للمضاد الحيوي والسمية الكمومية في مساء اليومين السابقين لتجربة الاقتران.

قم بتلقيح 10 ملليلتر من وسط LB باستخدام مستعمرة حديثة من بكتيريا e coli. في اليوم التالي، وقبل بدء التجربة بساعة إلى ساعتين، قم بملء كل بئر من آبار لوحة 96 بئراً شفافة. باستخدام وسط النمو، يجب ترتيب لوحة المقايسة كما هو موضح هنا.

يجب توزيع العينات في أطباق مكررة ثلاث مرات، كما يجب أن تغطي تركيزات المضادات الحيوية نطاقاً واسعاً بما يكفي ليشمل تركيزاً واحداً يثبط البكتيريا بدرجة ضئيلة جداً وتركيزاً آخر يقتلها جميعاً. كما ينبغي تضمين جميع الآبار التي تحتوي على النقاط الكمية (quantum dots) بالتركيزات التي ستُستخدم في تجارب الاقتران في ثلاث مكررات أيضاً. وباستخدام ماصة متعددة القنوات، يتم ملء الآبار المناسبة من 1 إلى 50 µL من المزرعة البكتيرية.

سيعتمد التركيز على سرعة نمو السلالة المحددة وسيتطلب المعايرة وفقاً لذلك. ولمراقبة النمو، ضع الطبق في قارئ الأطباق واضبطه للقراءة كل 10 دقائق لمدة ساعتين عند 600 نانومتر. عندما تصل جميع الخلايا إلى OD تتراوح بين 0.1 و0.15، قم بإزالة الطبق من قارئ الأطباق وأوقف التسجيل.

بعد ذلك، أضف PMB في النقاط الكمومية إلى الآبار المناسبة، وقم بتغطية نصف الطبقة بورق الألمنيوم في ثلاث مكررات. ثم ضع الطبقة تحت مصباح 440 nanometer مخصص مصنوع من LEDs بقوة 2.4 milliwatt لمدة 30 دقيقة لتعريض الجانب المضاء من الطبقة. بعد التعرض للضوء، ضع الطبقة في قارئ الطبقات وسجل OD 600 كل 10 دقائق لمدة تتراوح من خمس إلى 12 ساعة اعتماداً على معدل النمو. حافظ على درجة الحرارة أقل من 32 degrees Celsius قدر الإمكان لتجنب جفاف المزارع باستخدام البرمجيات.

قم بتعيين منحنيات النمو عند نقطة زمنية محددة مقابل اللوغاريتم لتركيز المضاد الحيوي، ثم حدد قيمة IC 50 للمضاد الحيوي باستخدام معادلة هيل (hill equation) الموضحة على الشاشة، حيث يمثل H معامل هيل. تمثل Y max أعلى نقطة نمو، بينما تمثل Y min نقطة الصفر والتي يفضل أن تكون أيضاً عند مرحلة الثبات. وفي نهاية فترة التسجيل، ستشير الآبار الرائقة إلى موت الخلايا الكامل، ومن المفترض أن يظهر تدرج في كثافة الخلايا مع زيادة تركيزات الدواء.

يجب أن تُظهر البكتيريا منحنيات نمو على شكل حرف S كما هو موضح هنا. وسيختلف موقع الهضبة القصوى بشكل كبير من سلالة إلى أخرى كما يعتمد أيضاً على درجة الحرارة. يمكن اختيار نقطة زمنية معينة لتكون ممثلة، ثم رسم القيم مقابل log المضاد الحيوي لإيجاد IC 50 لتقييم النقاط الكمومية.

يمكن أيضاً رسم مخطط للبقاء على قيد الحياة مقابل لوغاريتم تركيز النقاط الكمومية، ولكن نادراً ما يتم تحقيق قتل بكتيري ملحوظ باستخدام النقاط الكمومية وحدها بالتركيز المستخدم. وبمجرد تحديد سمية النقاط الكمومية والمضادات الحيوية بشكل منفصل، يمكن تطبيق البروتوكول نفسه لتحديد سمية المضاد الحيوي. تظهر النقاط الكمومية المقترنة.

فيما يلي مثال لتنسيق المقايسة. يُلاحظ أن المترافقات تُختبر بتراكيز متزايدة في مكررات رباعية، ويجب تضمين شريط تحكم يحتوي على البكتيريا فقط، وشريط يحتوي على الدواء فقط، وآبار عينات للنقاط الكمومية فقط. يمكن بعد ذلك استخدام قراءات OD 600 لإنشاء منحنيات النمو، وأرى قيم IC50 كما سبق.

يوضح هذا الشكل مثالاً لمركبات مقترنة لها سمية مماثلة للمضاد الحيوي وحده، ومثالاً لمركبات مقترنة أكثر سمية. ولتحديد عدد الوحدات المكونة للمستعمرات أو CFU لكل حالة، اختر بئراً واحدة أو أكثر من طبق 96 بئراً المعالج لاستخدامها في إجراء عد الأطباق. قم بعمل تخفيف تسلسلي لكل عينة من العينات البكتيرية المختارة باستخدام محلول ملحي.

للقيام بذلك، يتم سحب 180 µL من المحلول الملحي بالماصة ونقله إلى الأعمدة المناسبة. يتم نقل 20 µL من المحلول البكتيري وتخفيفه باستخدام 180 µL من المحلول الملحي. استبدل رأس الماصة، ثم اخلط وانقل 20 µL من المحلول البكتيري المخفف إلى 180 µL من المحلول الملحي.

كرر هذه العملية ست مرات. بعد ذلك، خذ 10 µL من كل واحدة من التخفيفات الست الأخيرة وقم بتنقيطها على طبق ثقب مستطيل. يمكن تنقيط 36 نقطة على طبق مستطيل.

اترك الطبق ليجف لمدة 15 دقيقة على سطح المختبر، وبعد مرور 15 دقيقة، قم بتحضين الطبق عند 37 °C لمدة 16 ساعة. عقب عملية التحضين، قم بعد المستعمرات لتحديد عدد الوحدات المكونة للمستعمرات لكل ملليلتر. اضرب عدد المستعمرات في عامل التخفيف ثم اقسم الناتج على الحجم المصبوب في الطبق لتحديد تأثير المعاملات على النمو البكتيري.

تم قياس كثافة خلايا e coli عند OD 600. تظهر هنا منحنيات نمو بكتيرية ممثلة بتركيزات مختلفة من الدواء، بدءاً من الصفر وصولاً إلى الموت الخلوي الكامل. تشير الرموز المفتوحة إلى استخدام PMB فقط مع توضيح التركيزات المحددة.

تمثل الرموز المصمتة C-D-T-E-P-M-B بدون تشعيع، بينما تمثل الرموز نصف الممتلئة C-D-T-E-P-M-B مع التشعيع. لم يكن للتشعيع أي تأثير على العينات التي تحتوي على PMB فقط، لذا تم حذف هذه المنحنيات من أجل وضوح العرض. توضح هذه المخططات قيم منحنى النمو عند 200 دقيقة مقابل لوغاريتم PMB، مع مطابقة هذه المعادلة لتحديد قيم IC 50 من أجل التحكم في تأثيرات الضوء.

تم رسم منحنى باستخدام المضاد الحيوي فقط مع التعرض للضوء لمدة 30 دقيقة. يوضح هذا الشكل بقاء البكتيريا على قيد الحياة عند 200 دقيقة مقابل تركيز QD باستخدام CDTE qds. لوحظ وجود بعض السمية مع التعرض للضوء، ولكنها ضئيلة جداً لدرجة لا تسمح بتحديد قيمة IC 50.

يشير هذا إلى أن سمية CDTE بمفرده بالتركيزات المستخدمة في تجربة الاقتران ضئيلة بحيث يمكن مقارنة تأثيرات المعالجات المختلفة على منحنى نمو الخلايا، حيث تم رسم قيم نمو الخلايا عند 200 دقيقة ومطابقتها مع المعادلة الموضحة سابقاً كما يظهر هنا. وكانت مقترنات C-D-T-E-P-M-B أكثر سمية من PMB بمفرده. وفي المقابل، لم تظهر مقترنات جسيمات الذهب النانوية A-U-P-M-B أي زيادة في السمية مقارنة بـ PMB بمفرده لتحديد تأثير المعالجات على بقاء البكتيريا.

تم تحديد عدد الوحدات المكونة للمستعمرات لبكتيريا e coli الموضوعة في لوحة ذات 96 بئراً ومعالجة بـ P-M-B-Q-D-P-M-B أو QD وحده، مع أو بدون إشعاع I لمدة 30 دقيقة، ثم حُضنت عند 32 °C لمدة أربع ساعات. تم إجراء تخفيفات تسلسلية لكل عينة بكتيرية باستخدام محلول ملحي، وزُرع 10 µL من محاليل بتركيزات من 100x إلى 10⁷x على أطباق آغار. حُضنت الأطباق عند 37 °C وتم عد المستعمرات بعد 16 ساعة.

في هذا المثال، تمثل أعمدة الطبق من A إلى C بكتيريا عولجت بتركيزات متزايدة من CDTE. أما الأعمدة من D إلى F فهي بكتيريا عولجت بتركيزات متزايدة من الملازمات دون تعريضها للإشعاع. وتظهر التخفيفات على طول الصفوف، جنبًا إلى جنب مع التعريض للإشعاع لمدة 30 دقيقة.

تشير البيانات إلى أنه عند التشعيع، تظهر المترافقات تثبيطاً أكبر لنمو البكتيريا مقارنة بالمترافقات بدون تشعيع. تذكر أن الكواشف التي تحتوي على الكالسيوم سامة للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل ارتداء القفازات، ومعاطف المختبر، والنظارات الواقية أثناء تنفيذ هذا الإجراء. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية إجراء الفرز عالي الإنتاجية للتأثير المضاد للبكتيريا للجسيمات النانوية سواء كانت مترافقة مع المضادات الحيوية أو بدونها.