توجه التمييز بين الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة نحو الخلايا اللمفية تي

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد وتوصيف الخلايا اللمفاوية T من الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات (IPS cells). يمكن بعد ذلك تمايز خلايا IPS مختبرياً على نظام زراعة OP9 DL1 ثم إنضاجها حيوياً في فأر ناقص المناعة من نوع rag. أو يمكن هندسة الخلايا وراثياً للإفراط في تعبير OT1 TCR ثم نقلها بالتبي (adoptively transferred) للتطوير الحيوي.

بعد ستة أسابيع من التمايز في الجسم الحي، يمكن تعريض الفئران للتحدي عن طريق الحقن داخل الصفاق بخلايا ورم EEG seven، ومن ثم يمكن تقييم النوعية المستضدية للخلايا التائية المشتقة من IPS. في نهاية المطاف، يمكن لخلايا IPS أن تتمايز إلى خلايا تائية تقليدية وأخرى نوعية للمستضد، حيث تكون الأخيرة قادرة على حماية الحيوانات من تحدي الورم. وتمتد آثار هذه التقنية نحو تفريد العلاج المناعي للسرطان.

تتيح هذه الطريقة توليد أعداد كبيرة من الخلايا التائية المتفاعلة مع الورم والمشتقة من الحد الأدنى من دم المريض أو أنسجة الجلد. في اليوم صفر، يتم نقل 5 × 10⁴ من خلايا IPS إلى طبق زراعة مقاس 100 مليمتر يحتوي على طبقة أحادية متلاحمة من خلايا OP9.DL1 في وسط alpha MEM يحتوي على 20% FBS. في اليوم الخامس، يتم إجراء عملية التريبسين (trypsinize)، ثم تُفصل الخلايا بالطرد المركزي بعد تحضينها في طبق زراعة جديد مقاس 100 مليمتر لمدة 30 دقيقة في حضانة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. يتم زرع 5 × 10⁵ من الخلايا العائمة في وسط alpha MEM يحتوي على 20% FBS وربيطة mouse FLT3 في طبق جديد مقاس 100 مليمتر يحتوي على طبقة أحادية من خلايا OP9.DL1. في اليوم الثامن، يتم سحب الخلايا ذات الالتصاق الضعيف برفق باستخدام الماصة، وتُفصل الخلايا بالطرد المركزي، ثم تُنقل الخلايا إلى بئر واحدة من طبق زراعة سداسي الآبار مغطى بخلايا OP9.DL1 متلاحمة. يتم تحضين الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5% carbon dioxide لمدة أسبوعين إضافيين حتى اليوم 22.

قم بتحضين خلايا IPS المنفصلة في أوساط نمو جديدة في طبق زراعة جديد عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، قم بإزالة حوالي نصف الخلايا العائمة وتمريرها عبر مصفاة نايلون بمسام 70 ميكرون لاستبعاد تجمعات الخلايا، واغسل معلق الخلايا المفردة الناتج ثلاث مرات باستخدام PBS بارد. بعد الغسلة الثالثة، أعد تعليق الخلايا في PBS بتركيز 1.5 × 10⁷ خلايا لكل ملليلتر، واحفظ الخلايا على الثلج قبل الحقن الوريدي (IV).

ضع فأراً من سلالة rag deficient يبلغ من العمر أربعة أسابيع تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء لتوسيع الوريد الذيلي. بعد ذلك، املأ حقنة سعة 1 mL مزودة بإبرة قياس 26.5 بـ 200 µL من معلق الخلايا وقم بنقل الخلايا تبنيّاً عبر الوريد الذيلي المتوسع. بعد مرور ثلاثة أسابيع، وعقب التأكد من القتل الرحيم للفأر الذي خضع للنقل التبنيّ، قم باستئصال العقد اللمفاوية والطحال بعد تفتيت الأنسجة ميكانيكياً.

قم بتحلل معلق الخلايا المفردة باستخدام محلول منظم للتحلل (CK lysis buffer)، ثم اغسل الخلايا الوحيدة الناتجة مرتين باستخدام PBS بارد. بعد ذلك، وبعد صبغ مؤشرات سطح الخلية، قم بتقييم الخلايا بواسطة تحليل قياس التدفق الخلوي في اليوم صفر؛ واستخدم كاشف ترانسفكشن gene JAMA لنقل OT one MIDR لليلة واحدة إلى خلايا plat E التعبئة في اليوم الأول. وفي اليوم الثاني، قم بزراعة 1×10⁶ من خلايا IPS في بئر واحد من طبق يحتوي على 24 بئراً مطلياً مسبقاً بـ 0.1% gelatin. وفي اليوم الثالث، اجمع السوبرناتانت (S natin) المحتوي على الفيروسات الكاذبة من خلايا plat E، ثم مرره عبر مرشح بمقاس 0.4 ميكرون لاستبعاد الملوثات المحتملة بعد عملية الطرد المركزي. قم بنقل الجينات إلى الخلايا بوجود poly brain لمدة ساعة واحدة عند 330 ×g وفي درجة حرارة 32 °C.

قم بتحضينها طوال الليل عند درجة الحرارة ذاتها بعد تكرار إجراء ترانسدوكشن (transduction). في اليوم الرابع، استخدم التربسين (Trypsin) لرفع خلايا IPS التي خضعت للترانسدوكشن، وبعد تجميع الخلايا في شكل كريات، أعد تعليق الخلايا في وسط غذائي جديد وازرعها على خلايا مغذية snl 7 6 7 مشععة ومكودة مسبقاً. وبمجرد وصول الخلايا التي خضعت للترانسدوكشن إلى مرحلة الالتحام (confluency)، قم بفرز الخلايا موجبة التعبير المزدوج لـ GFP و DS red باستخدام قياس التدفق الخلوي (flow cytometry).

بعد ستة أسابيع من النقل التبني للـ IPS cells، قم بحقن 50 µL من خلايا EEG seven thoma في التجويف البريتوني للفأر نفسه في اليوم 50 من تحدي الورم. استخدم طقم عزل خلايا T الموجبة لـ CD8 من mil E biotech لفرز خلايا T الموجبة لـ CD8 من الطحال والعقد الليمفاوية للحيوان الذي خضع للنقل التبني. اخلط خلايا T الموجبة لـ CD8 المعزولة مع SPOC size مشع من فأر naive C 57 black six J بنسبة 1 إلى 10، وقم بتحفيز المزرعة المشتركة بـ 0.5 µmol/mL من ova لمدة 40 ساعة.

بعد ذلك، أضف felden A إلى الخلايا لمدة أربع ساعات أخرى. وأخيراً، قم بتقييم المجموعات الخلوية عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي بعد عزل SP cytes من فأر C 57 black six J سليم. قم بتقسيم معلق الخلايا إلى مجموعتين.

قم بتمييز مجموعة CFSE العالية بـ 5 µM من CFSE ونبض الخلايا بـ 10 µg/ml من ببتيد ova لمدة ساعة واحدة، وقم بتمييز مجموعة CFSE المنخفضة بـ 0.5 µM من CFSE دون إجراء عملية النبض. اخلط 2.5 × 10⁶ من خلايا CFSE العالية مع 2.5 × 10⁶ من خلايا CFSE المنخفضة في محلول PBS. بعد ذلك، قم بتحليل الخلايا بواسطة قياس التدفق الخلوي للكشف عن تعبير CFSE.

بعد 16 ساعة من النقل التبيّني إلى الفأر المستهدف. ولعدّ الخلايا الورمية داخل الصفاق في اليوم 20 من تحدي الورم، استخدم سرنجة سعة 10 ملليلتر مجهزة بإبرة قياس 18.5 وPBS بارد لغسل التجويف الصفاقي. ثم قم بعدّ الخلايا الورمية المستخلصة لتحديد الخلايا المتسللة إلى الورم.

قم بإزالة الورم في مرحلة متأخرة من تحدي الورم، ثم قطع الورم إلى ثلاث قطع. ضع قطعة الورم الأولى في أنبوبة تجميد (cryo vial) وضع الأنبوبة على الثلج الجاف. قم بتثبيت القطعة الثانية فوراً باستخدام الفورمالديهايد.

يُحفظ الجزء الثالث في وسط RPMI 1640 مُكيَّف بعد تجفيف مقاطع الأنسجة المحفوظة بالتجميد في الهواء. ثم تُثبَّت في أسيتون بارد لمدة 15 دقيقة بعد تجفيف المقاطع المُثبَّتة في الهواء لمدة 15 دقيقة أخرى. تُغسل الشرائح لمدة خمس دقائق في PBS بعد عملية الغسل.

ضع الشرائح في غرفة رطبة وقم بتغطية مقاطع النسيج بـ 30 µL من 3%B, SA و PBS لمدة 30 دقيقة لمنع الارتباط غير النوعي. ثم قم بتجفيف محلول الحجب وامضخ مقاطع النسيج بمزيج قدره 50 µL من pe anti TCR RV alpha two antibody و fitzy anti ova antibody مخفف في 3%PSA في PBS داخل الغرفة الرطبة لمدة ساعتين. وفي نهاية فترة الحضن، اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام PBS البارد، وأخيراً قم بتثبيت المقاطع باستخدام وسط تثبيت مائي قبل الفحص المجهري الفلوري لتحليل الخلايا التائية المرتشحة للورم عن طريق قياس التدفق الخلوي.

قم بسحق الورم لتحويله إلى معلق خلوي أحادي. ثم قم بتحليل الخلايا للبحث عن علامات سطحية محددة. استُخدمت CD3 وTCR beta كعلامات للخلايا التائية لتحديد ما إذا كان تحفيز خلايا IPS باستخدام ربيطة notch DL1 يمكن أن يساهم في تعبير الخلايا التائية عن CD4 وCD8 على السطح؛ حيث تم تقييم تعبير CD4 وCD8 على سطح خلايا مشتقة من خلايا IPS وكانت موجبة لـ CD3 وموجبة لـ TCR beta.

لاحظ المخطط النقطي على اليمين الذي يوضح الخلايا التائية أحادية الإيجابية CD3 إيجابية وTCRβ إيجابية وCD4 سلبية وCD8 إيجابية، والتي تم إنتاجها من خلايا IPS في المختبر في اليوم 22. بالإضافة إلى ذلك، أنتجت الخلايا أحادية الإيجابية المشتقة من خلايا IPS في الشكل السابق إنترلوكين 2 وإنترفيرون غاما عند تحفيزها في المختبر باستخدام أجسام مضادة لـ CD3 مطلية على الأطباق وأجسام مضادة ذائبة لـ CD28، مما يؤكد أن الخلايا التائية المشتقة من خلايا IPS وظيفية بعد النقل التكيفي إلى الفئران المستقبلة. خضعت غالبية خلايا IPS التي تم نقل جين TCR إليها لعملية تمايز إلى خلايا CTL إيجابية لـ CD8، والتي استجابت في المختبر للتحفيز بالببتيد من خلال إفراز إنترلوكين 2 وإنترفيرون غاما في هذه المخططات النقطية المأخوذة من خلايا مجمعة من العقد اللمفاوية والطحال.

تم توليد خلايا T موجبة لـ CD8 وموجبة لـ V β5 في الفئران التي نُقلت إليها تكييفياً خلايا IPS محولة بـ TCR، وليس الخلايا المحولة الضابطة. وكانت المجموعات الموجبة لـ CD8 والموجبة لـ V β5 موجبة للتلوين السيتوكيني داخل الخلايا لإنتاج إنترلوكين 2 وإنترفيرون غاما، والتي تم تمثيلها في هذه الرسوم البيانية بالخطوط الداكنة مقارنة بالرسوم البيانية المظللة للضابطة النمطية (isotype control)، مما يشير إلى أن خلايا CTL المشتقة من IPS كانت وظيفية. وتُظهر هذه البيانات أن الخلايا ذات المحتوى العالي من CFSE والمحفزة بالببتيد، والتي تمثلها القمم الموجودة على اليمين في كل رسم بياني، والخلايا الضابطة ذات المحتوى المنخفض من CFSE، والتي تمثلها القمم الموجودة على اليسار، والتي حُقنت في الفئران بعد 10 أسابيع من نقل خلايا IPS أو بعد يوم واحد من نقل خلايا O OT1 CTL.

استجابت الخلايا التائية السامة للخلايا (CTLs) المشتقة من الخلايا الجذعية المحرضة (iPS) والنوعية للمستضد لتحفيز المستضد، وأظهرت نشاطاً ساماً للخلايا كما يتضح من غياب الخلايا ذات المستوى العالي من CFSE هنا. تم نقل خلايا iPS المنقولة جينياً بمستقبل الخلايا التائية (TCR) من OT-I تبنيّاً إلى فئران C57BL/6، ثم خضعت الفئران للتحدي بخلايا ورم EGD-7، وفي اليوم 20 تم تعداد الخلايا الورمية في التجويف الصفاقي. لاحظ الانخفاض الملحوظ في أعداد الخلايا الورمية في الفئران التي تلقت خلايا iPS المنقولة جينياً بـ TCR مقارنة بمجموعات الضبط.

والأهم من ذلك، أن النقل التبني لـ خلايا IPS التي تم تحويلها بواسطة TCR أدى إلى تحفيز ارتشاح الخلايا اللمفاوية التائية السامة (CTLs) مفرطة التفاعل إلى أنسجة الورم، وحمى الحيوانات من تحدي الورم، كما يظهر في هذا الصبغ بـ H and E لأنسجة الورم التي تم استردادها في الأيام من 30 إلى 35 بعد تحدي الورم؛ حيث ظهرت الأورام في الفئران التي خضعت للنقل التبني للخلايا المحولة بـ TCR أو خلايا OT one CTLs، ولكن ليس في حالة الحقن الوهمي أو المجموعة الضابطة. وقد ارتشحت الخلايا المحولة بواسطة خلايا التهابية كما تشير الأسهم الحمراء هنا. كما وُجد أن خلايا CTLs موجبة لـ V alpha two النوعية لـ Ova (باللون الأحمر) قد ارتشحت إلى أنسجة الورم التي تعبر عن Ova (باللون الأخضر).

بينما أظهرت الأورام في الفئران من المجموعات الضابطة وجود خلايا أقل أو عدم وجود خلايا متسللة إلى الورم في هذا الشكل، فقد تم تحليل المعلقات الخلوية المنفردة من أنسجة الأورام للكشف عن تعبير V alpha two الإيجابي وV beta five الإيجابي عن طريق قياس التدفق الخلوي بعد تحديد مجتمع CD eight الإيجابي. يلاحظ أن أنسجة الأورام من الفئران التي نُقلت إليها خلايا IPS محولة بـ TCR تكييفياً أظهرت أعلى مستوى من الخلايا المتسللة إلى الورم، بينما لم تظهر الأورام في الفئران التي تلقت خلايا IPS محولة ضابطة أي تسلل لخلايا T الإيجابية لـ CD eight النوعية لـ ova.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد خلايا T محددة للمستضد من خلايا IPS وكيفية تقييم وظائف خلايا T المشتقة من خلايا IPS.