تجميد مستورقة، التشعيع جزئي، والنسج

الهدف العام من التجربة التالية هو وضع مجموعة من الخلايا الجذعية السليمة بجوار أنسجة تم استئصال خلاياها الجذعية داخل حيوان الباريان، وذلك بهدف تحليل سلوكيات الخلايا الجذعية وسلالاتها في الجسم الحي أثناء عملية التجدد. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تخدير وتثبيت حيوان باريان غير مشع أو مشع بالأشعة الورقية لإجراء المزيد من المعالجات. بعد ذلك، يتم حجب حيوان الباريان غير المشع والمثبت جزئياً باستخدام الرصاص ثم تعريضه للأشعة السينية، مما ينتج عنه حيوان باريان غير مصاب يحتوي على أنسجة مستأصلة الخلايا الجذعية مجاورة للأنسجة المحجوبة التي لا تزال محملة بالخلايا الجذعية.

وبدلاً من ذلك، يمكن نقل طعم نسيجي مأخوذ من متبرع غير معرض للإشعاع إلى مضيف تعرض للإشعاع مسبقاً، وذلك من أجل إنتاج كائن يحتوي على مجموعة معزولة من الخلايا الجذعية. وتؤدي النتائج التي تم الحصول عليها من المضيف الذي تم استئصال خلاياه الجذعية إلى إظهار مجموعات معزولة من الخلايا الجذعية بجوار الأنسجة التي استؤصلت منها الخلايا الجذعية، وذلك عن طريق التهجين الموضعي للحمض النووي الريبوزي (RNA in situ hybridization) للعينة الكاملة باستخدام جينات علامة الخلايا الجذعية.

تهدف الطرق الموصوفة هنا إلى تحقيق فهم أفضل لتجدد الديدان المسطحة (planarians) من خلال دراسة سلوك الخلايا الجذعية في كل من نموذج الزرع ونموذج التشعيع الجزئي، مما يتيح لنا اختبار ما إذا كانت الأنسجة المحيطة والبيئات المحلية التي تقطنها هذه الخلايا الجذعية تؤثر أو لا تؤثر على سلوك هذه الخلايا الجديدة (neoblasts) أو الخلايا الجذعية. خلال عملية التجدد، وقبل شهر إلى شهرين من التجربة، يتم تغذية الديدان وفقاً للمخطوطة المرفقة. وللحصول على الحجم المطلوب في هذا العرض، يتم اختيار ديدان يتراوح طولها بين 1-2 cm ويزيد عرضها عن 2 mm.

بعد ذلك، يتم تجويعها لمدة تتراوح من ثلاثة إلى سبعة أيام قبل الاستخدام. تلي ذلك مرحلة تحضير محلول Chlorotone، وهو مخدر موضعي خفيف، عن طريق إذابة 0.1 إلى 0.2% وزن/حجم من cleone في الماء النقي. ثم يتم تبريد المحلول على الثلج من أجل عملية نقل الأنسجة. وباستخدام موقد بنزن، يتم ثني أنبوب شعري بقطر داخلي يبلغ 0.75 millimeter على مسافة تتراوح من واحد إلى اثنين سنتيمتر من الطرف بزاوية 90 درجة لقطع النسيج المطعّم.

بعد ذلك، قم بثني أنبوب شعري آخر بقطر خارجي يبلغ 0.7 millimeter عند مسافة تتراوح من واحد إلى اثنين سنتيمتر من الطرف بزاوية 90 درجة، وذلك لعمل ثقب في المضيف لاستقبال الطعم. بعد ذلك، قص ورقة ترشيح Watman رقم 3 السوداء، وورق ترشيح Kim wipe، وورق لف السجائر وفقاً للأحجام الموضحة في المخطوطة المرفقة.

بعد ذلك، قم بتحضير محلول Holt Fers المعدل ومحلول Caine Holt Fretter المشبع. قم بتبريدهما حتى 4 °C. ثم قم بتثبيت منديل Kim wipe مطوي على مربع من Paraform.

ضعه على لوحة مبرد Peltier أو أي جهاز تبريد آخر تحت مجهر تشريحي. بعد ذلك، قم بتشبيع منديل Kim بمحلول Holt Fretter المبرد. ثم ضع مستطيلين من ورق الترشيح الأسود فوق منديل Kim.

ضع الآن قطعة من ورق ترشيح واتمان (Watman) رقم 2 في طبق بتري. قم بترطيب ورق الترشيح باستخدام محلول هولت فريتر (Holt Fretter). ثم برد الطبق فوق الثلج من أجل التشعيع الجزئي.

ضع بطانة ورقية أكبر في طبق أكبر على غرار عملية نقل الأنسجة. قم بترطيب ورق الترشيح باستخدام محلول Holt Fretter. بعد ذلك، برد الطبق على الثلج.

في هذا الإجراء، املأ طبق بتري بمحلول cleone مبرد. استخدم الماصة لنقل Planaria إلى الطبق لإجراء عملية الزرع. قم بتخدير مضيف واحد ومتبرع واحد فقط في كل مرة.

بالنسبة للإشعاع الجزئي، يمكن تخدير العديد من الحيوانات في وقت واحد. بعد ذلك، تُترك حيوانات paria لتُنقع في محلول cleone لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق حتى تصبح ساكنة. تُشطف حيوانات paria عن طريق نقلها بواسطة الماصة إلى طبق مملوء بمحلول Holt Fretter المبرد.

بعد ذلك، قم بتثبيت منطقة plin عن طريق نقله بواسطة الماصة إلى أوراق ترشيح سوداء مشبعة بمحلول Holt fretter المبرد. ثم قم بتوجيهها بحيث يكون الجانب البطني للأسفل باستخدام ملقط. الآن، ضع طبق بتري مبرد تم تحضيره مسبقاً في دلو ثلج بحيث يتناسب مع جهاز التشعيع بالأشعة السينية (X-ray irradiator) ذو المصدر العلوي.

رتب المنطقة المخدرة من Plin في طبق بيتري عن طريق تحريك أوراق الترشيح السوداء. ثم انقلها إلى مصدر الأشعة السينية العلوي، وضع دلو الثلج بحيث تكون المسافة من أنبوب الكاثود إلى paria في حدها الأدنى؛ وذلك لزيادة معدل الجرعة الفعال إلى أقصى حد.

ثم ضع دروع الرصاص بين العينات وأنبوب الكاثود لجرعة الأشعة السينية. إذا كان المطلوب هو استئصال كامل للخلايا الجذعية من المناطق غير المحمية، يتم توجيه 30 grays أو أكثر. فور انبعاث الأشعة السينية، انقل العينة إلى ماء باريان مبرد.

بعد ذلك، اترك المياه الباريانية لتصل إلى درجة حرارة الغرفة، واسمح للحيوانات بأن تتحرر من ورق الترشيح الأسود. وبذلك تكتمل عملية التشعيع الجزئي. لبدء هذا الإجراء تحت المجهر التشريحي، قم بترتيب منطقة المضيف والمُعطي المخدرين على أوراق ترشيح سوداء مستطيلة منفصلة فوق منديل Kim wipe، والذي تم تبريده مسبقاً على لوحة بيلتير أو لوحة التبريد.

استخدم أنبوبًا شعريًا بقطر داخلي يبلغ 0.75 millimeter لاستئصال سدادة الطعم من المانح. ثم استخدم ملقطًا لوضعها في جزء بعيد عن منطقة العمل من المضيف. بعد ذلك، استخدم أنبوبًا شعريًا بقطر خارجي يبلغ 0.7 millimeter لإزالة سدادة من المضيف.

بعد ذلك، ضع الطعم في الثقب. انقل المضيف المزروع الموجود على ورق الترشيح الأسود المستطيل إلى طبق بيتري الذي تم تحضيره مسبقاً. بلل قطعة من ورق اللف بمحلول Holt Fretter المشبع بـ Caine.

ثم ضعها فوق المضيف المنقول. بعد ذلك، انقع أربع قطع من ورق الترشيح في محلول Holter المشبع، وفي حال غمر المضيف المنقول لاحقاً، انقع أربع كتل من مناديل Kim المقطوعة في محلول Holt Fretter المشبع. ضعها فوق أوراق الترشيح.

بعد ذلك، أغلق الغطاء. ضع طبق بتري على الثلج. ثم انقل الباريان المانح إلى مياه الباريان للاسترداد والتجديد.

عند الانتهاء من جميع عمليات النقل، ضع الـ parian المنقول في حاضنة عند درجة حرارة 10 degree Celsius طوال الليل. وفي صباح اليوم التالي، انقله إلى أطباق Petri مملوءة بماء الـ parian. اترك الـ parian لينفصل تلقائياً عن ورقة الترشيح أو قم بإزالته بلطف باستخدام الملاقط، ثم قم بتغيير ماء الـ parian مرة كل يومين أو ثلاثة أيام بعد ذلك.

يظهر التهجين الموضعي (in situ hybridization) في العينة المثبتة لسمكة الباريان (parian) التي تعرضت للإشعاع ولكنها كانت محمية بالكامل بعد ثلاثة أيام من التعرض للإشعاع، توزيعاً للخلايا الجذعية لا يمكن تمييزه عن توزيعها في سمكة الباريان من النوع البري. ومن ناحية أخرى، بالنسبة لسمكة الباريان التي كانت محمية جزئياً فقط، مما ترك الأجزاء الأمامية والخلفية مكشوفة، يبدو أن الخلايا الجذعية قد استُؤصلت من المناطق غير المحمية. يوضح هذا الشكل المنظرين الظهري والبطني لسمكة باريان تم نقل زراعتها بنجاح.

بعد ثلاثة أيام من عملية الزرع، تظهر الطعمة بوضوح على كل من السطحين الظهري والبطني، وتكون محاطة بأنسجة غير مصطبغة مميزة عند الواجهة بين الطعمة والمضيف. ومع ذلك، لا تظهر عمليات الزرع غير الناجحة أي أنسجة طعوم مرئية في موقع الزرع. وكشف التهجين الموضعي للعينة الكاملة عن وجود الخلايا الجذعية فقط في موقع الطعمة أو حوله، مما يشير إلى نجاح عملية الزرع بمجرد إتقانها.

يمكن إجراء عمليات الزرع في وقت قصير يصل إلى خمس دقائق لكل منها. ومع وصول معدلات النجاح إلى ما يقرب من 90 إلى 100%، يمكن زيادة نطاق التشعيع الجزئي بشكل كبير، بافتراض أن حجم مجال جهاز التشعيع لديك كبير بما يكفي.