في Electroporation البيضة في الدماغ المتوسط ​​الفرخ لدراسة وظيفة الجينات في الخلية العصبية الدوبامين التنمية

توضح هذه التجربة عملية التثقيب الكهربائي في البيضة (in ovo electroporation) للدماغ المتوسط لدى الكتاكيت لدراسة تأثير تعبير الجينات الخارجية على تطور الدماغ المتوسط وتمايز الخلايا العصبية الدوبامينية. أولاً، يتم حقن الدماغ المتوسط لأجنة الكتاكيت في المرحلة 11 وفقاً لمقياس هاميلتون (Hamilton) بالبلازميد المطلوب، DNA، لاستهداف DNA الخارجي بشكل محدد في حويصلة الدماغ المتوسط النامية. بعد ذلك، وباستخدام أقطاب كهربائية صغيرة مصنعة خصيصاً، يتم إجراء التثقيب الكهربائي لحويصلة الدماغ المتوسط لإيصال DNA الخارجي تحديداً إلى السلف العصبي للدماغ المتوسط.

بعد ذلك، يتم جمع أجنة المرحلة 23 التي تظهر تعبيراً جيداً لبروتين M cherry في الدماغ المتوسط، ثم تحضير مقاطع عرضية مثالية للدماغ المتوسط. وفي النهاية، يمكن لتحليل التلوين المناعي لعلامات الخلايا العصبية الدوبامينية، مثل tyrosine hydroxylase، أن يوضح تمايز السلائف العصبية إلى خلايا عصبية دوبامينية ناضجة محفزة عن طريق التعبير عن الجينات المستهدفة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية الأخرى للتثقيب الكهربائي في البيضة (in ovo electroporation) في أن هذا البروتوكول يمكنه تحقيق تثقيب كهربائي متخصص بالغشاء لدراسة تمايز الخلايا العصبية الدوبامينية.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول تطور الدماغ المتوسط، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أجزاء أخرى من الجهاز العصبي لإجراء تحليل تخطيط المصير، وللبحث في تنظيم التعبير الجيني. ومن أجل الحصول على أجنة هامبرغر هاميلتون في المرحلة 11، ضع كل بيضة مخصبة على جانبها وضع علامة بشرطة قلم رصاص في الأعلى. ثم ضع الصواني على هزاز في حاضنة مرطبة مسبقة التسخين.

تحقق من الرطوبة ومستوى الماء كل 24 ساعة عند مرور 41 ساعة على الإخصاب. أخرج البيض من الحاضنة واحفظه في درجة حرارة الغرفة. نظف سطح كل بيضة باستخدام 70%ethanol ثم جففه بالمسح.

الآن، ضع قطعتين من شريط لاصق بطول 4 cm جنباً إلى جنب على البيضة لتشكيل مستطيل كبير فوق علامة قلم الرصاص. قم بتمليس الشريط على البيضة لتأطير النافذة باستخدام سرنجة سعة 10 mL متصلة بإبرة قياس 18 gauge. اثقب قشرة البيضة مع توجيه الإبرة بزاوية بعيدة عن المح، وذلك لتجنب إزعاج أو إتلاف الجنين.

اسحب خمسة ملليلتر من الألبومين من البيضة. نظف الإبرة باستخدام 70%ethanol. جفف الإبرة قبل ثقب البيضة التالية.

أدخل الإعدادات الخاصة بسحب الماصات الدقيقة باللهب. ثم اسحب أنابيب شعيرية رقيقة الجدران لتحويلها إلى إبر حقن باستخدام ماصة P 10. اسحب من 5 إلى 10 µL من محلول البلاسميد في طرف ماصة شعيرية طويل.

ثم قم بتعبئة الإبرة الزجاجية ببطء بحيث يتكون عمود مستمر خالٍ من فقاعات الهواء. ضع الإبرة المعبأة في حامل الإبر المتصل بالمتحكم الدقيق والمحقن الدقيق. والآن، وباستخدام مجهر التشريح مع خلفية داكنة لتحسين رؤية الإبرة، قم بقص الإبرة عند النقطة التي يتوقف عندها السائل الأخضر باستخدام مقصات نابضية.

قم بقص نافذة بقطر يتراوح من 2 إلى 2.5 سم من خلال فتحة الإبرة السابقة، وذلك لسحب الألبومين. قم بتدوير البيضة بيد واحدة أثناء عملية القص.

تذكر تنظيف المقص باستخدام منديل kim مشبع بـ 70%ethanol بين كل بيضة وأخرى. انتقل إلى فحص جنين الدجاج تحت مجهر التشريح. إذا لزم الأمر، قم بتوضيح رؤية الجنين عن طريق حقن 20%India ink في PBS مُرَشح بـ 0.22 micrometer تحت جنين الدجاج. ضع الجنين بشكل موازٍ لمسار الإبرة بحيث يكون الرأس بعيداً عنها.

قم بثقب الأنبوب العصبي ببطء بزاوية 45 درجة عند نقطة الاتصال بين الدماغ المتوسط والدماغ الخلفي. ابدأ الحقن باستخدام المحاقن الدقيقة pico spritzer مع ضبط المدة على 25 milliseconds. اضبط الوقت بناءً على طول الإبرة، واملأ الحويصلة العصبية التي تمثل الدماغ المتوسط فقط بـ plasmid DNA المحتوي على صبغة fast green.

بعد سحب إبرة الحقن، ضع ثلاث قطرات من محلول البنسلين والستربتومايسين على الجنين. تحقق من إعدادات جهاز B-T-X-E-M-C eight 30 electro por لضمان إجراء عملية تثقيب كهربائي فعالة. عند موضع الدماغ المتوسط البطني، ضع الأقطاب الكهربائية البلاتينية الصغيرة المصممة خصيصاً على شكل حرف L في نفس المستوى الأفقي مع الجزء السفلي من الأنبوب العصبي، بحيث يتمركز الدماغ المتوسط للجنين بين القطبين.

اضغط على مفتاح القدم الخاص بجهاز BTX مرة واحدة ولاحظ فقاعات الهواء المتولدة حول الأقطاب الكهربائية. بعد كل عملية تثقيب كهربائي ناجحة، قم بإزالة الأقطاب الكهربائية من البيضة بعناية وامسحها. باستخدام منديل كيميائي مبلل بإيثانول 70%، ضع ثلاث قطرات أخرى من محلول البنسلين والستريبتومايسين على الجنين.

قم الآن بتغطية النافذة بقطعة من شريط التغليف الشفاف بحجم 5 cm × 5 cm. قم بإغلاق البيضة بإحكام دون لمس محتوياتها، ثم أعد البيض إلى المحضنة مع إيقاف تشغيل أقراص التدوير. عند الوصول إلى المرحلة المطلوبة، يتم جمع الأجنة الحية في طبق بتري مشترك مملوء بـ PBS لكل حالة تجريبية.

بعد ذلك، يُستخدم مجهر تشريح فلوري. يتم فحص الأجنة المجمعة للكشف عن تعبير m cherry، ثم تُنقل الأجنة الإيجابية إلى آبار فردية في طبق يحتوي على 24 بئراً. يملأ كل بئر بـ 1 mL من 2% paraformaldehyde المحضر حديثاً، وتُحضن لمدة ثلاث ساعات عند 4 °C.

اغسل الأجنة المثبتة في PB S ثلاث مرات، ثم ضع الأجنة في سكر السكروز بتركيز 15% حتى تتم المزامنة عند التوازن. كرر عملية التوازن في سكر السكروز بتركيز 30%، ثم قم بتضمين كل جنين في مركب OCT مع توجيه الأجنة بشكل صحيح للحصول على مقاطع عرضية مثالية للدماغ المتوسط من أجل التحليلات اللاحقة.

قم بتحضير مقاطع من الدماغ المتوسط السميك باستخدام الميكروتوم المبرد (cryostat) بسماكة 18 ميكرون من أجل التحليلات اللاحقة في مقايسة التثقيب الكهربائي في ovo للدماغ المتوسط للجنين في الدجاج hh. تُحقن أجنة الدجاج في المرحلة 11 بمزيج بلازميدي يتكون من العلامة الفلورية m cherry والجينات المستهدفة، بالإضافة إلى تتبع مصبوغ باللون الأخضر السريع (fast green) لعملية الحقن. بعد التثقيب الكهربائي للدماغ المتوسط، تُحضن الأجنة لفترة إضافية، ثم تُجمع الأجنة الموجبة لـ m cherry ويتم تثبيتها وطمرها.

بعد ذلك، يتم تحضير مقاطع تجميدية من الدماغ المتوسط. وتُحلل العينات عن طريق التلوين المناعي باستخدام علامات الدماغ المتوسط مثل tyrosine hydroxylase في أجنة الدجاج التي تم حقنها وعمل التثقيب الكهربائي لها بنجاح. وعادةً ما يكون تعبير M cherry مرئياً في منطقة الدماغ المتوسط بعد مزيد من النمو، وذلك باستخدام تعبير m cherry كعلامة للحقن.

يتم بعد ذلك تثبيت الأجنة التي تظهر تعبيراً مناسباً لـ m cherry، ثم طمرها وتوجيهها لتحضير مقاطع تجميدية من الدماغ المتوسط. هنا، يتم فحص تحديد المصير الدوباميني في السلائف العصبية التي خضعت لعملية التثقيب الكهربائي من خلال التموضع المشترك لـ m cherry والجين الملحق بـ flag مع مؤشر العصبونات الدوبامينية tyrosine hydroxylase. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قصر التعبير الجيني إقليمياً على سلائف العصبونات الدوبامينية في الدماغ المتوسط الجنيني، بما في ذلك كيفية حقن بنيات DNA تحديداً في منطقة الدماغ المتوسط، وكيفية تحديد موقع التثقيب الكهربائي باستخدام أقطاب كهربائية صغيرة مصنعة خصيصاً بعد اتباع هذا الإجراء.

يمكن استخدام طرق أخرى مثل الإغلاق بوساطة RNI أو التعبير عن المعززات المرتبطة بجينات تقريرية لدراسة وظيفة الجينات وتنظيمها في مناطق وأنواع خلوية محددة من الجهاز العصبي.