إعداد عامل نمو الخلايا T من Splenocytes الجرذ

مرحباً، أنا كريستين بيتون، باحثة مساعدة في مختبر جورج تشن في قسم الفسيولوجيا والفيزياء الحيوية بجامعة كاليفورنيا في إرفاين. وسأوضح لكم على مدار اليومين القادمين كيفية تحضير TCGF، وهو اختصار لعامل نمو الخلايا التائية (T cell growth factor).

بالنسبة لزراعة الخلايا اليومية، عندما لا نحتاج إلى معرفة دقيقة بتركيب السيتوكينات في وسط الزراعة، فإننا نستخدم عامل نمو الخلايا التائية (T-cell growth factor)، وهو عبارة عن سائل طافي من زراعة طحال الجرذان يحتوي على السيتوكينات اللازمة للمساعدة في تكاثر الخلايا التائية. وتتم طريقة تحضير TCGF من خلال التضحية بجرذان لويس السليمة، ثم استئصال طحالها، وتحضير معلق من الخلايا المفردة، والتخلص من خلايا الدم الحمراء عن طريق تحللها، ومن ثم نقوم بتحفيز الخلايا أحادية النواة باستخدام con A، مما سيؤدي إلى تحفيز الخلايا التائية لإنتاج جميع السيتوكينات المطلوبة لنموها. ولتوليد TCGF، نحتاج إلى تنشيط الخلايا.

تتمثل الطريقة التي نتبعها في إضافة ليكتين Concanavalin A، والمختصر بـ Con A، إلى المزرعة الخلوية. فعندما نضيف Con A إلى المزرعة الخلوية، فإنه سيرتبط بمعقد مستقبلات الخلايا T المغلذفة بالجليكوزيل، ومن خلال الارتباط بعدة معقدات في آن واحد، سيؤدي ذلك إلى ما نسميه "التغطية" (capping). وبذلك سيعمل على تجميع كافة المستقبلات في عنقود على سطح الخلية، مما سيؤدي إلى تحفيز إشارة تنشيط في الخلايا اللمفاوية T.

لذلك، بعد تنشيط الخلايا، ستبدأ في عملية الانفجار (blast)، حيث يتزايد حجمها ثم تبدأ في إفراز السيتوكينات. في الأصل، كنا نعتقد أن عامل نمو الخلايا التائية (TCGF) هو بشكل أساسي إنترلوكين 2، ولكننا نعلم الآن أن الأمر ليس كذلك حقاً.

كما أنه يحتوي على interferon gamma وTNF alpha وربما أيضاً بعض السيتوكينات بكميات صغيرة جداً تكون ضرورية فقط لإبقاء الخلايا حية بعد 48 ساعة. في المزرعة، أنتجت الخلايا جميع السيتوكينات التي نحتاجها. لذا سنقوم بإزالة الخلايا، وعندما نزيل الخلايا ونحصل على السائل الطافي فقط، سيظل هناك بعض الـ conal الحر في السائل الطافي. وسيشكل ذلك مشكلة لأننا نريد حقاً استخدام عامل نمو الخلايا التائية (T-cell growth factor) للحفاظ على نمو خطوط الخلايا التائية.

وإذا تركنا الـ Con A حراً في المحلول، فسوف يقوم بتنشيط الخلايا في وقت لا نريد فيه تنشيطها. لذا، ولتجاوز هذه المشكلة، سنضيف فائضاً من سكر يرتبط بكل الـ Con A الحر الموجود. وبذلك سيتم تثبيطه تماماً ولن يرتبط بالمستقبلات المغلوزة الأخرى الموجودة على الخلايا عند إضافة TCGF إلى المزرعة.

فلنبدأ الآن. تتمثل الخطوة الأولى في هذه التجربة في استخراج الطحال من الجرذ فور القتل الرحيم. وهذا ما سأقوم به على الفور باستخدام أدوات معقمة.

وبمجرد استخراج الطحالين، سأضعهما في محلول PBS مدعم بالمضادات الحيوية، وأستخدم البنسلين والستربتومايسين كمضادات حيوية. لذا دعونا نبدأ. أقوم الآن برش الجرذ بـ 70% ethanol لضمان عدم حدوث أي تلوث في المزرعة.

بعد ذلك، وباستخدام أدواتي، سأقوم بإجراء قطع صغير في الجلد هنا. ثم أزيل طبقة من العضلات ليظهر الطحال هنا تماماً. لذا، سأستخدم ملقطاً آخر لسحب الطحال برفق دون إتلافه.

أقوم بإزالة الأنسجة الضامة بهذا الشكل. وهكذا أصبح لدي الآن طحال. وبالطبع، أتوخى الحذر الشديد لعدم إتلاف أي شيء آخر داخل التجويف البطني، لأن أي ضرر يلحق بالأمعاء سيؤدي إلى تلوث فوري للطحال.

بعد ذلك، سأقوم بنقل الطحال إلى أنبوب يحتوي على PBS بالإضافة إلى المضادات الحيوية. وأحتفظ بهذا الأنبوب على الثلج. وهكذا، أكون قد انتهيت من استخراج الطحال من ثلاثة جرذان.

لقد أصبحنا مستعدين الآن لتحضير معلق خلوي أحادي من هذه الطحالين. وبما أنني حصلت على الطحالين، فقد نقلتهما إلى غطاء تدفق هوائي لزراعة الأنسجة لتحضير معلق خلوي أحادي منهما باستخدام مصافٍ خلوية بمسامية 70 micron. سأحتاج إلى عدة أشياء لتحضير المعلق الخلوي الأحادي من الطحالين.

أحتاج إلى أدوات معقمة، ملقط واحد ومقص واحد. ثم أضع مكبس حقنة معقمة سعة 1 mL في طبق بتري. سأقوم بوضع الطحال في PBS مضاف إليه مضادات حيوية.

وفي طبق بتري آخر، وضعت مصفاة خلايا بمسامية 70 ميكرون في 10 milliliters من PBS مضافاً إليه مضادات حيوية. لذا، فإن الخطوة الأولى هي التأكد من نظافة الطحال، لأنه كما تلاحظون هنا، لا تزال هناك قطع صغيرة من النسيج الضام، وسأقوم بإزالتها لأنها ستؤدي إلى انسداد مصفاة الخلايا بسرعة كبيرة. وللقيام بذلك، أقوم ببساطة بقص الأجزاء غير المرغوب فيها والتخلص منها في غطاء طبق بتري.

لقد أصبحت الطحال الآن نظيفة في الغالب، لذا سأقوم بأخذ الطحال واحدًا تلو الآخر، ووضعها في مصفاة الخلايا (cell trainer) وتقطيعها إلى قطع صغيرة، ثم أمزج الطحال الثلاثة معًا. الخطوة التالية هي تحضير معلق خلوي أحادي. وبالطبع، نظرًا لرغبتي في الحفاظ على تعقيم كل شيء، لن ألمس مصفاة الخلايا على الإطلاق، وسأستخدم مكبس حقنة معقمة سعة 1 mL لضغط قطع الطحال عبر مصفاة الخلايا.

وكما ترون في الجزء الخارجي من جهاز تدريب الخلايا، يتم تحضير معلق من الخلايا المفردة. لذا، في الدورة الأولى، لا تزال هناك بعض القطع الصغيرة من الطحال، ولكنني سأقوم بالفعل بسحب معلق الخلايا المفردة، وقد نقلته بالفعل إلى أنبوب سعة 50 مل أقوم بحفظه على الثلج.

سأقوم بإعادة ملء مصفاة الخلايا بـ 10 mL إضافية من PBS والمضادات الحيوية. لذا، سآخذ حوالي 10 mL أخرى من PBS مع المضادات الحيوية، ولا يشترط أن تكون الكمية 10 mL بدقة شديدة، فنحن نقوم بعملية غسيل فقط. أضعها في مصفاة الخلايا ثم أتبع نفس الإجراء.

أعود إلى مكبس المحقنة وأضغط من خلال الـ ocid قليلاً بعد. وبطبيعة الحال، لن تتمكن أبداً من تمرير كل شيء لأن هناك أنسجة ضامة وقطعاً صغيرة من الدهون لم أتمكن من إزالتها وسوف تظل في مصفاة الخلايا. ولكن يجب أن تمرر غالبية الطحال إلى مصفاة الخلايا.

وبعد ذلك، سأكرر تماماً ما فعلته سابقاً؛ حيث سأقوم بجمع معلق الخلايا المفردة وإضافته إلى السن نفسه. في هذه المرحلة، لم يتبقَّ شيء تقريباً من المادة الموجودة على المنخل في جهاز غربلة الخلايا، كما أن محلول PBS الناتج أصبح أكثر صفاءً بكثير. وسأقوم ببساطة بالغسل مرة أخرى، ومن المفترض أن نكون قد استخرجنا معظم الخلايا الآن.

الآن لديّ معلق الخلايا المفردة من خلايا PLE، وسأقوم بطردها مركزياً ببساطة لترسيبها. سيكون الطرد المركزي لمدة 8 إلى 10 دقائق كافياً. لقد قمنا الآن بطرد خلايا PLE مركزياً وأصبح لدينا راسب جيد.

سأقوم الآن بالتخلص من الطافي، ثم سأعمل على تحلل خلايا الدم الحمراء. لذا، سأقوم بتعليق الخلايا العضلية في كلوريد الأمونيوم؛ حيث سأستخدم محلولاً من كلوريد الأمونيوم بتركيز 0.15 molar، وبكمية 5 milliliters لكل طحال.

بما أن لدي ثلاثة طحالات، فسأستخدم 15 milliliters من كلوريد الأمونيوم وسأقوم بذلك على الثلج. ولتحليل كريات الدم الحمراء، سأقوم بسحب السائل وإطلاقه بلطف باستخدام الماصة لمدة ثلاث دقائق. حسناً، سنستخدم هذه اللقطة ذات التعريض الأعلى هنا.

لقد انتهيت الآن من تحليل الخلايا الكهربائية لمدة ثلاث دقائق. سأقوم بملء الأنبوب بمحلول PBS، كما يمكنكم استخدام الوسط الزرعي أيضاً؛ وذلك لإعادة أسمولية المحلول إلى النطاق الطبيعي للخلايا.

وسأقوم بطرد الخلايا مركزياً كما فعلت سابقاً لمدة 8 إلى 10 دقائق لترسيبها. ثم سأقوم بغسلها مرتين باستخدام محلول PBS نفسه المحتوي على المضادات الحيوية. والآن نقوم بطرد الخلايا مركزياً بعد تحلل الخلايا الكهربائية، ولا تقلقوا فنحن لا نحصل أبداً على تحرر كامل بنسبة 100% للخلايا الكهربائية.

وبذلك ستظل الرواسب حمراء، ولكن السائل الطافي سيكون أكثر نقاءً. والآن سأقوم بتفريغ السائل الطافي، وتفكيك الرواسب، ثم إضافة محلول PBS حتى 50 mil، والتدوير بالطرد المركزي، وتكرار هذه الخطوة مرة أخرى لضمان إجراء غسلتين. وبعد ذلك سأتمكن من عد الخلايا بنفسي. لقد قمت بغسل الخلايا العضلية Twice، ثم علقتها في وسط زراعة، وقم بتعدادها باستخدام مقياس الخلايا.

كما هو متوقع. حصلتُ من ثلاثة طحالين على حوالي 600 مليون خلية، وهو أمر متوقع بما أن الطحال الواحد يعطينا عادةً من 200 إلى 250 مليون خلية. لذا، سأقوم الآن بزراعة الخلايا بكثافة 2 مليون خلية لكل مل في الوسط الزرعي المدعم بـ 10% fetal calf serum.

وسأقوم بإضافة 2 µg/mL من conc A إلى ذلك الوسط لتحفيز الخلايا. وبعد ذلك، سأضع الخلايا ببساطة في الحاضنة لمدة 48 ساعة. لقد بقيت الخلايا الآن في الحاضنة لمدة 48 ساعة، وكما سأوضح لكم، فقد نمت بشكل جيد جداً.

تحول لون الوسط إلى البرتقالي. لذا، نحن الآن مستعدون لإنهاء تحضيرنا لـ TCGF. كما تتذكرون، لقد أضفت con carnaval إلى معلق الخلايا الخاص بي لتنشيط الخلايا.

إذًا، مادة concanavalin A هي ليكتين، حيث ترتبط بالسكريات الموجودة على جميع مستقبلات الخلية التائية (T-cell) وتعمل على تنشيط جميع تلك الخلايا بشكل اصطناعي. والمشكلة التي تواجهنا الآن هي أنه لا يزال هناك بعض من مادة concanavalin A في الطافي (supernatant) للخلية.

وبما أننا سنستخدم السنا ت (snat) في مستنبتات أخرى للخلايا التائية (T cell) لتوسيع الخلايا، فإننا لا نريد وجود الكون كارنافال (con carnaval) في تلك المستنبتات الخلوية. لذا، وللتخلص منه، سأقوم بإضافة كمية فائضة من السكر الذي يرتبط به الكون نافال (con naval)، وهو ميثيل ألفا دي سايت (methyl alpha D cyte) الموضح هنا. وسأقوم بإضافة كمية فائضة من هذا السكر وإذابته تماماً.

سوف يرتبط بكل ما تبقى من conc naval، وبمجرد الانتهاء من ذلك، سأقوم بترشيح رواسب الخلايا باستخدام مرشح معقم، ثم سأقوم بتجميد جميع السوائل لاستخدامها في الأسابيع أو الأشهر القليلة القادمة. لذا، لنبدأ بهذه الخطوة الأخيرة؛ حيث أقوم الآن بإضافة سائل زراعة الخلايا إلى أنابيب سعة 50 mil لنتمكن من إجراء عملية الطرد المركزي للتخلص من الخلايا.

لذا، أقوم ببساطة بملء عدد الأنابيب اللازمة، ولا أفعل ذلك داخل غطاء زراعة الخلايا؛ يمكنني القيام بذلك، ولكن بما أنني سأحتاج في النهاية إلى ترشيح المحلول لأنني أضفت السكر، وهو غير معقم، فإنني أقوم بذلك ببساطة على طاولة المختبر، فهذا أسهل. لقد سكبت الآن جميع الخلايا والسائل الطافي في أنابيب فالكون سعة 50 mil.

لذلك، سأنقلها إلى جهاز الطرد المركزي وأقوم بتدويرها لمدة 10 دقائق تقريبًا. والسبب الوحيد لتدويرها هو ترسيب الخلايا حتى أحصل على طافٍ نقي. لقد تم ترسيب الخلايا الآن، لذا أصبح الطافٍ نقيًا، وهذا هو ما أردت جمعه.

سأقوم بتجميع كل السائل الطافي في دورق نظيف بسعة 150 سنتيمتراً مربعاً. وسأضيف السكر إلى هذا الدورق. وبينما كانت الخلايا تترسب أثناء الطرد المركزي، قمت بوزن كمية كافية من السكر لإضافة 15 milligram per ml من السائل الطافي.

سأتركه يذوب تماماً، وبعد ذلك سأقوم بإجراء ترشيح معقم للطاف مادة الرائق. والآن سأضيف السكر بتركيز 15 mg/ml من الرائق. سأعيد وضع الغطاء، وبما أنني لا أعمل في ظروف معقمة، فلا يهم إذا التصق بعض السكر بالغطاء، لذا سأقوم بالخلط حتى يذوب كل السكر.

من المفترض أن تكون هذه العملية سريعة للغاية. نعم، لقد ذاب كل السكر الآن. لذا، كل ما علي فعله هو ترشيح السائل الطافي باستخدام مرشح معقم، ومن ثم سأقوم بتقسيمه إلى حصص صغيرة.

عادةً ما أقوم بتوزيع العينات في حصص حجم كل منها 10 إلى 15 مل وأقوم بتخزينها عند درجة حرارة -20 °C. ويمكن تخزين هذه الحصص لعدة أشهر. كما يمكنك تخزين TCGF في الثلاجة، وفي هذه الحالة، سأستخدمه خلال الـ 10 إلى 15 يوماً القادمة.

على مدار اليومين الماضيين، أوضحتُ لكم كيفية تحضير عامل نمو الخلايا التائية، وهذا الطافي بسيط جداً في تصنيعه وغير مكلف في تحضيره. لذا، فإننا نستخدمه بشكل متكرر في المختبر للحفاظ على خطوط الخلايا التائية في المزارع الخلوية دون الحاجة إلى شراء مجموعات باهظة الثمن من السيتوكينات. أتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.