قياس حركية تقدم دورة الخلية مع وصفها الأيض والتدفق الخلوي

الهدف العام من الإجراء التالي هو قياس حركية وتطور الدورة الخلوية. أولاً، يتم وضع الخلايا في مرحلة وسوم النبض والمطاردة باستخدام romo أو deoxy أو uridine أو BRDU، والذي يتم دمجه في الحمض النووي للخلية بدلاً من الثيميدين. بعد ذلك، يتم صبغ الخلايا مناعياً باستخدام أجسام مضادة ضد BRDU وتحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي مباشرة بعد الصبغ.

يتم وسم الخلايا الموجودة في طور S فقط، ومع تقدم هذه الخلايا المسمومة عبر دورة الخلية إلى طور G2، يتم اكتشافها على أن لها محتوى DNA يبلغ 4N بعد عملية الانقسام الفتيلي. ثم ينخفض محتوى DNA إلى 2N. وبذلك، يمكن استخدام تحليل أنماط الفلورة الناتجة عن قياس التدفق الخلوي لتحديد حركية تقدم دورة الخلية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالبروتوكولات الأخرى التي تستخدم المواد الكيميائية لمزامنة الخلايا في عدم وجود اضطرابات فسيولوجية قد تؤثر عن غير قصد على آلية انقسام الخلايا. لقد استخدمنا هذه الطريقة لأول مرة عندما أعطتنا محاولاتنا لدراسة معدل تقدم دورة الخلية باستخدام المزامنة الكيميائية نتائج غير متوقعة تداخلت مع تحليلاتنا. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال بيولوجيا الخلية.

على سبيل المثال، ما هو الأساس الذي تقوم عليه معدلات النمو التفاضلية بين أنواع الخلايا المختلفة؟ لبدء هذا البروتوكول، قم بعمل وسم "نبضة-مطاردة" (pulse-chase) للخلايا باستخدام BRDU. ابدأ بوسم طبق واحد بقطر 10 سنتيمتر لكل نقطة زمنية، بالإضافة إلى طبق واحد لكل من الضوابط التالية.

BRDU فقط، PI فقط، BRDU سلبي، PI سلبي. يتم استزراع كل طبق بـ 5×10⁵ من خلايا MCF-7 في وسط DMEM مضاف إليه المكملات. تُحضن الأطباق لمدة 24 إلى 48 ساعة للسماح للخلايا بالتعافي والالتصاق. وبمجرد وصول الخلايا إلى نسبة تغطية 60%، يُستبدل الوسط بوسط DMEM جديد يحتوي على 10 µM.

قم بتحضين الخلايا بـ BRDU لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية و 5%CO2 للسماح بدمج BRDU في DNA. تأكد من ترك طبق واحد دون معالجة ليعمل كعينة ضابطة سلبية أو كنقطة زمنية صفر بعد مرور ساعة واحدة. قم بإزالة وسط الوسم النبضي واغسل الخلايا لفترة وجيزة باستخدام PBS وصولاً إلى النقاط الزمنية من ساعتين إلى ثماني ساعات.

أضف وسط نمو جديداً وأعد الأطباق إلى الحاضنة. بعد ذلك، قم على الفور بحصد الأطباق عند النقطتين الزمنيتين صفر وساعة واحدة كما هو موضح في القسم التالي. لحصد الخلايا، قم بشفط الوسط وشطف الطبق.

يتم غسل الخلايا أولاً باستخدام PBS، ثم يُضاف التريبسين لفصل الخلايا عن الطبق وجمعها في وسط DMEM، ثم تُوضع في جهاز الطرد المركزي بسرعة 390 ×g لمدة خمس دقائق. يتم التخلص من السائل الطافي. بعد ذلك، تُغسل الخلايا في 1 إلى 5 ملليلتر من PBS المبرد على الثلج، ثم تُوضع في جهاز الطرد المركزي بسرعة 390 ×g لمدة خمس دقائق. بعد عملية الطرد المركزي، يتم التخلص من السائل الطافي وإعادة تعليق الخلايا في 100 µL من الثلج.

محلول PBS بارد يحتوي على 1% FBS. يساعد الـ FBS في منع تكتل الخلايا. أحد أهم جوانب هذا الإجراء هو التأكد من الحصول على معلق خلوي أحادي من الخلايا التي تم حصادها.

من أجل الحقائق. ولتحقيق ذلك، يمكنك إضافة خلاياك مباشرة إلى الإيثانول قطرة بقطرة. وهذا أمر بالغ الأهمية. لتثبيت الخلايا، استخدم الماصة لإضافة الخلايا قطرة بقطرة إلى خمسة مليلتر من ice code.

إيثانول بنسبة 70% في أنبوب مخروطي سعة 15 ملي لتر. تُحضن الخلايا على الثلج لمدة 30 دقيقة أو تُخزن في درجة حرارة أربع درجات مئوية طوال الليل. وتعد هذه الخطوة مثالية لإيقاف عملية جمع العينات من النقاط الزمنية المختلفة، حيث يمكن ترك العينات في الإيثانول لعدة أيام، مما يسمح بمعالجتها في وقت واحد خلال بقية البروتوكول لإجراء صبغة BrdU ويوديد البروبيديوم.

أخرج الخلايا من درجة حرارة 4 °C وقم بطردها مركزياً عند 90 ×g ثلاث مرات لمدة خمس دقائق. بعد عملية الطرد المركزي، اسحب معظم سائل التثبيت مع ترك حوالي 50 µL تقريباً. ثم استخدم جهاز الـ vortex.

لخلخلة الراسب من أجل مسخ DNA أثناء الرج الميكانيكي (vortexing). أضف ملليمتر واحد من HCL بتركيز 2 normal مع Triton X 100 ببطء على شكل قطرات، ثم حضن العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. قم بترسيب الخلايا عن طريق طرد العينات مركزياً لمدة خمس دقائق بسرعة 390 ×g، ثم اسحب السائل الطافي وتخلص منه.

ثم أعد تعليق كريّة الخلايا في 1 mL من رباعي بورات الصوديوم بتركيز 0.1 M. بعد عملية الطرد المركزي، قم بشفط الخلايا مرة أخرى والتخلص من السائل العلوي. ثم أعد تعليق كريّة الخلايا في 75 µL من صبغة BRDU.

امزج المكونات واحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة، مع حمايتها من الضوء بعد عملية الحضن. قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي كما سبق، ثم أعد تعليق كتلة الخلايا المترسبة في واحد ملليمتر من PBS يحتوي على خمس ميكروجرام لكل ملليمتر من perdium iodide. عند تمرير العينة الموجبة لـ PI عبر جهاز قياس التدفق الخلوي، أنشئ مخططاً للتشتت الأمامي مقابل التشتت الجانبي لضمان التوزيع الصحيح لأحجام الخلايا.

يجب رسم كلا هذين المعلمتين على مقياس خطي. وفي الوقت ذاته، قم بعرض مخطط لـ FL three H مقابل FL two W لمشاهدة صبغ PI مقابل عرض نبضة الفلوريسنت. يُستخدم هذا المخطط لإنشاء بوابة (gate) لعزل جزء الخلايا التي يُعتقد أنها تقع ضمن نمط التوزيع الطبيعي لدورة الخلية.

بشكل عام، يتميز نمط التوزيع هذا بوجود مجموعتين من الخلايا ذات محتوى 2N و 4N من صبغ PI، واللتين تمثلان طوري G1 و G2 من دورة الخلية على التوالي. أما سلسلة الخلايا الموجودة بين هاتين المجموعتين فهي تمثل عملية تضاعف DNA الجارية في طور S من دورة الخلية. قم بإنشاء مخطط يعرض الخلايا المحددة (gated cells) مع وضع FL1-H أو FITC بمقياس لوغاريتمي على محور Y، و PI بمقياس خطي على محور X.

سيتم استخدام هذا المخطط لضبط المعلمات المتبقية باستخدام عناصر التحكم المختلفة وكذلك لجمع البيانات. ولإجراء التحليل، ضع عينة صبغ PI فقط في منفذ تحميل جهاز قياس التدفق الخلوي، ثم اضبط الكسب لوضع G1 عند حوالي 200 على المحور x. سيكون من الأسهل تصور ذلك في مخطط مدرج تكراري لصبغ PI.

بعد ذلك، ضع العينة التي تحتوي على BRDU فقط في منفذ التحميل وابدأ التشغيل. اضبط الكسب بحيث تظهر مجموعتا الخلايا، الموجبة لـ BRDU والسالبة لـ BRDU، على المخطط. ومن الناحية المثالية، يجب أن تكون الخلايا السالبة لـ BRDU متمركزة عند 10¹ أو أسفله مباشرة.

تتمثل الضابطة النهائية في عينة BDU/PI السالبة. يتم تشغيل هذه الضابطة السالبة للتأكد من عدم ظهور الخلايا في أي من المربعات العلوية أو اليمنى. وبمجرد ضبط معاملات المخططات المختلفة، يتم معايرة جهاز قياس التدفق الخلوي ويصبح جاهزاً لمعالجة الخلايا المصبوغة بـ BRDU وPI. يتم جمع البيانات من 10,000 خلية على الأقل من الخلايا المحددة بـ PI لكل عينة.

ثم باستخدام برامج مثل FlowJo أو fax diva، قم بإنشاء مخطط يربط بين FITC وPI مع تحديد الخلايا كخلايا موجبة لـ PI من مخطط PI مقابل FL two W، وذلك لتمييز الجمهرة الخلوية في حالة الانقسام. بعد ذلك، قم بإنشاء بوابة ثانية لعزل الجمهرة الموجبة لـ BRDU.

ثم لتتبع المجرى الزمني لتقدم الدورة الخلوية، قم برسم عدد الخلايا الموجبة لـ BRDU ذات محتوى G one أو G two كدالة في الزمن لمقارنة حركية تقدم الدورة الخلوية بين خطين خلويين لسرطان القولون والمستقيم هما HT 29 و LS 180. جُمِعت الخلايا كل ساعة لمدة ثماني ساعات بعد إزالة نبضة A-B-R-D-U.

عند مقارنة حركية الملفين الشخصيين، يظهر بوضوح ظهور قمة G1 عند الزمن t يساوي أربع ساعات بعد BRDU في خلايا LS 180 مقارنة بنقطة الزمن المقابلة لخط خلايا HT 29، والذي يفتقر إلى هذه القمة. يشير هذا إلى تسارع تقدم الدورة الخلوية عبر طور G2 من الدورة الخلوية. في خط خلايا سرطان القولون والمستقيم LS 180 لإنشاء ملف دوري لخط خلايا سرطان الثدي.

تم جمع خلايا MC seven كل ساعة لمدة ثماني ساعات، وذلك بعد إزالة نبضة BRDU. ثم جرى فرز الخلايا التي تم وسمها مناعياً وصبغ حمضها النووي بناءً على إشارات الفلورة الخاصة بها.

كما يمكن ملاحظته هنا، فإن خلايا CF seven قد انقسمت بمعدل أبطأ بكثير من أي من خطي خلايا سرطان القولون والمستقيم اللذين تم اختبارهما. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية السماح بالوسم الأيضي للحمض النووي DNA بالتزامن مع الحصاد في نقاط زمنية محددة بتتبع حركية الدورة الخلوية.