التصوير المقطعي الموجهة التصوير المقطعي منتشر الوقت المجال الإسفار في الحيوانات الصغيرة من أجل الترجمة من المؤشرات الحيوية للسرطان

الهدف العام من التجربة التالية هو إنتاج صور فلورية للتعبير عن مستقبل عامل نمو البشرة في نموذج فأر مصاب بورم دبقي في موضعه الأصلي. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تلقيح نصف الكرة المخية الأيسر لفأر A IIC بخلايا ورم دبقي بشري U2 51 تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر. وبعد نمو الورم لمدة أسبوعين، يتم حقن الفأر بمزيج من مقتفيين فلوريين.

بعد ذلك، يتم تصوير الفأر باستخدام نظام أشعة سينية للحيوانات الصغيرة لجمع البيانات التشريحية اللازمة لإعادة بناء الصورة بدقة. تُستخدم هذه البيانات لتحديد الموضع التشريحي للمصدر ومواقع الكشف في نظام التصوير المقطعي البصري، ويُستخدم برنامج مخصص لجمع بيانات الفلورة وبناء الصورة النهائية. وفي النهاية، يمكن لهذه الطريقة بناء صورة لورم بناءً على الفرط في تعبير عامل نمو البشرة باستخدام كل من التصوير بالفلورة والأشعة السينية، والتي يمكن مقارنة دقتها بالتصوير بالرنين المغناطيسي المعزز بالتباين.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل التصوير المقطعي الفلوري للحيوانات الصغيرة القائم على أجهزة الاقتران الشحني، في أن الكشف عن عد الفوتون الواحد باستخدام أنابيب مضاعف التصوير يوفر حساسية ومدى ديناميكيًا أعلى بكثير للكشف عن الضوء. ويمكن استخدام هذه الطريقة في نهاية المطاف لمراقبة وقياس نجاح العلاجات الجزيئية عن طريق قياس تعبير أهدافها. وبينما يمكن تصوير الأورام تحت الجلد بسهولة باستخدام طرق غير مقطعية تعتمد على التصوير السطحي، فإن هذا النظام مصمم للتصوير عبر الأنسجة التي يصل سمكها إلى عدة سنتيمترات، مما يجعله مناسبًا بشكل خاص لتصوير توصيل عوامل التباين وتسربها إلى أورام الدماغ.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة حول تعبير المؤشرات الحيوية للسرطان، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على دراسات أمراض أخرى مثل العدوى، أو السمنة، أو عناصر الشيخوخة مثل مرض Alzheimer's. وبشكل عام، سيواجه الأفراد المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة بسبب الطبيعة المنتشرة لانتشار الضوء في الأنسجة البيولوجية والصعوبة في استخدام التصوير المقطعي بالأشعة السينية لإعادة بناء الضوء المنتشر. لذا، يعد التوضيح المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية.

بما أن خطوات جمع البيانات وإعادة بناء الصور قد تكون صعبة التعلم، فمن المهم التأكد من معايرة البيانات التي تم جمعها من النظام الفلوري بشكل جيد. لقد صُممت حزمة برامج near fast لقراءة البيانات الضوئية واستخدام صور التصوير المقطعي بالأشعة السينية لإنشاء شبكة عناصر محدودة، والتي تُستخدم كقالب مكاني لإعادة بناء الفلورة. للبدء، ضع فأراً عارياً غير تيموسي (athymic nude mouse) تحت التخدير على غطاء جراحي معقم، وتحقق من عمق التخدير قبل المتابعة، ثم قم بتنظيف وتطهير الجلد فوق منطقة الشق.

باستخدام Betadine، ضع غطاءً جراحيًا معقمًا فوق موقع الشق، ثم استخدم المشرط لإجراء شق صغير إلى اليسار قليلاً من الخط الناصف و0.5 centimeters خلف الخط داخل العين. قم بتنظيف سطح الجمجمة عن طريق إزالة أي نسيج ضام حتى يمكن تحديد المعالم التشريحية. وبمجرد كشف الجمجمة، استخدم مثقابًا عالي السرعة مع ريشة معقمة بحجم one millimeter لإحداث ثقب يقع على بعد two millimeters إلى يسار الخط المركزي وtwo millimeters خلف bgma.

املأ حقنة Hamilton Micros المزودة بإبرة ذات طرف غير مدبب عيار 27 بالخلايا المراد زرعها. بعد ذلك، ضع الفأر على إطار التثبيت المجسم (stereotaxic frame). ثم تأكد من وصول الحيوان إلى مستوى تخدير جراحي وعميق عبر اختبار قرصة إصبع القدم، وأعد وضع الغطاء الجراحي على الحيوان.

بعد ذلك، قم بتثبيت المحقنة المملوءة على الإطار المجسم. ضع المحقنة فوق الفتحة الموجودة في الجمجمة، ثم أدخل طرف الإبرة لمسافة 3 mm أسفل سطح الجمجمة. بعد ذلك، اسحب الإبرة لمسافة 1 mm لإنشاء جيب.

تتمثل الخطوة التالية في حقن الخلايا ببطء في نصف الكرة المخية الأيسر على مدار خمس دقائق. وبمجرد اكتمال الحقن، يتم سحب الإبرة ومسح الثقب باستخدام Betadine. ولمنع نمو الخلايا خارج موقع الحقن، يتم إخراج الفأر من الإطار التجسيمي وملء الثقب المكشوف بشمع العظام المسخن مسبقاً.

أخيرًا، أغلق موقع الشق باستخدام خيوط جراحية من النايلون sterile five oh. أعد الفأر إلى قفص مدفأ وراقبه حتى يتعافى، وبعد التعافي، احقن الفأر بـ 130 µL من buprenorphine بتركيز 0.1 mg/kg عن طريق الحقن داخل الصفاق (IP)، واترك الورم ينمو لمدة 14 يومًا قبل التصوير. وفي يوم تصوير الفأر، قم بتشغيل النظام للسماح لليزرات وكواشف الضوء بالإحماء لمدة 20 دقيقة تقريبًا.

لتجنب الانحرافات وحساسية النظام، ضع ناشر خطوط هندسي بمقاس 100 درجة في 4 درجات في المركز المباشر للقنطرة التصويرية لتشتيت ليزرات الإثارة بين قنوات الكشف في النظام بكثافة متساوية. اضبط زاوية الناشر يدويًا لزيادة كمية الإشارة التي يتم رصدها بواسطة جميع قنوات تجميع الضوء الخمس. بعد ذلك، ضع الكثافة الضوئية.

مرشحان لكثافة متعادلة أمام جميع أنابيب المضاعف الضوئي للكشف الفلوري والتي تسمى PMTs والكثافة الضوئية. مرشح كثافة متعادلة واحد أمام جميع عمليات كشف النفاذية. تجمع أنابيب PMTs نحو 100 دالة انتشار نبضة زمنية أو T psfs لليزر، بحيث يكون لكل منها زمن تكامل قدره ثانية واحدة لكل ليزر بالتتابع، ثم يتم تطبيع كل TPSF بواسطة المرجع الليزري لتصحيح الانزياح الزمني في المرجع الليزري، ويؤخذ المتوسط عبر جميع التكرارات لكل كاشف ولكل ليزر على حدة.

تُعد قيم TPS المتوسطة هذه دوال استجابة للأجهزة خاصة بالكاشف، وتُستخدم في إعادة بناء الصور الضوئية قبل 12 ساعة من إجراء التصوير. قم بحقن فأر التجارب بمزيج من المتتبعات الفلورية. ويُعد المعايرة الدقيقة لنظام التصوير المقطعي الفلوري وتقييد حركة الحيوان من أصعب الجوانب في هذا الإجراء.

تعد عملية إعادة بناء الصور مسألة سيئة التحديد (ill-posed) لدرجة أن الأخطاء الطفيفة في جمع البيانات قد تؤدي إلى أخطاء جسيمة في الصورة المعاد بناؤها. ولضمان جمع بيانات دقيقة، نقوم بتثبيت الفأر قدر الإمكان وتكرار عملية المعايرة قبل المسح وبعده لتحسين فرصة الحصول على معايرة دقيقة. وعندما يصبح الأمر جاهزاً، ضع الحيوان المخدر على الدعامات المصنوعة من الألياف الزجاجية لسرير التصوير.

بعد وضع الرأس داخل المخروط الأنفي للتخدير الغازي المستمر، يتم تثبيت الأسنان على شريط العض وتثبيت الحيوان بالشريط اللاصق. يجب وضع الفأر في المركز التقريبي لهيكل التصوير. يمكن توجيه عملية الوضع هذه عن طريق تدوير ليزر الإثارة بمقدار 180 درجة حول الفأر، لضمان أن نقطة تركيز الليزر تضيء نقطة تقع تقريباً في مركز الفأر من منظور الليزر من جميع الزوايا.

بمجرد التموضع بشكل صحيح، انقل سرير التصوير والفأر بعناية إلى ماسح micro CT واجمع المعلومات التشريحية بدقة 93 micrometers isotropic للرأس الكامل للفأر. قم بمعاينة مجموعة صور CT واختر المقاطع التي سيتم تصويرها باستخدام نظام التصوير المقطعي الفلوري. انقل سرير التصوير والفأر بعناية مرة أخرى إلى نظام التصوير المقطعي الفلوري.

اختر عدد مواضع المصدر لكل شريحة تصوير، وزمن التكامل لكل قياس TPSF، وعدد التكرارات لكل موضع مصدر، بالإضافة إلى موضع وعدد شرائح التصوير المطلوبة من مجموعة صور CT التي تم إنشاؤها مسبقاً. بعد ذلك، ضع مرشحات أمام أنابيب المضاعف الضوئي (PMTs) الخاصة بالكشف عن الفلورة لحجب كل ضوء الإثارة، وضع مرشحات الكثافة المتعادلة أمام أنابيب المضاعف الضوئي الخاصة بالكشف عن النفاذية. ولتجنب تشبع هذه الكواشف، قم بتشغيل برنامج الحصول على البيانات لجمع t psfs الخاصة بالفلورة والنفاذية عند كل موضع مصدر وكاشف محدد عند كلا الطولين الموجيين للإثارة.

لكل مجموعة من الـ T psfs التي تم جمعها، قم بمراقبة وتسجيل شدة الليزر باستخدام قناة PMT مرجعية. حدد السطح الخارجي للفأر وموقع سرير التصوير. قم بدعم القضبان من صور CT وأنشئ أقنعة تغطي حدود الفأر وقضيب التصوير.

بشكل منفصل، استخدم قناع الفأر لإنشاء شبكة عناصر محدودة للحيوان باستخدام برنامج near fast. حدد مواقع المصدر والكاشف من نظام التصوير المقطعي الفلوري على سطح الشبكة بناءً على إحداثيات التسجيل المكاني للتصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro CT) والفلورة. قم بإزالة نقاط البيانات الضوئية المرتبطة بمواقع المصدر أو الكاشف التي تتداخل مع موقع سرير التصوير.

تعمل قضبان الدعم على تطبيع البيانات التي يتم جمعها عند كل موضع لكاشف المصدر عن طريق المرجع الليزري، وتصحيح الانزياح الزمني في المرجع الليزري، وتصحيح حساسيات المرشحات التي تم تحديدها من خلال الاختبارات التجريبية وقت الشراء. يتم حساب نسبة بورن (born ratio) للبيانات لكل موضع لكاشف المصدر وضربها في محاكاة النموذج الأمامي للنفاذية بناءً على شبكة العناصر المحدودة للحيوان ذات الخصائص البصرية الموحدة. يتم القيام بذلك للتخفيف من الأخطاء المرتبطة باقتران المصدر أو الكاشف بالأنسجة، ومعايرة البيانات وفقاً للنموذج، وتعديل البيانات لمواكبة الجوانب الأخرى من عدم تطابق بيانات النموذج؛ ثم يتم إنشاء متجه بيانات يتكون من الفرق المقياس لبيانات نسبة بورن التي تم جمعها عند كلا الطولين الموجيين.

يتم اختيار عامل القياس لزيادة تباين ارتباط EGFR إلى أقصى حد، ثم يتم إجراء إعادة بناء للصورة في النطاق الزمني باستخدام بيانات الفرق المعايرة مع استخدام TPSF لكل قناة كشف كمدخل، وإنشاء خرائط فلورية للمقتفي المستهدف المعزز بالتباين. فيما يلي مثال على إعادة بناء فلورية متراكبة مع صورة تشريحية لـ CT مسجلة إحداثياً من فأر مصاب بورم دبقي U2 51 في موضعه الأصلي. وكان مركز كتلة الورم الدبقي الذي تم تحديده بواسطة إعادة البناء الفلورية ضمن نطاق واحد مليمتر من مركز كتلة الورم، الذي تم تحديده بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي المعزز بالتباين.

إن برنامج الحصول على البيانات مصمم خصيصاً لهذا الجهاز، ولكن يمكن تنفيذ معظم تقنيات معالجة الصور باستخدام برمجيات near fasts المتاحة على nearfasts.org. لذا، عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم التأكد من معايرة كل من النظام والبيانات بدقة قبل إعادة بناء الصورة. وتتطلب هذه المعايرة مراعاة الاختلافات في الحساسية والفروق الزمنية بين الكواشف بعد إعادة بناء صورة لمتتبع مستهدف لعلامة بيولوجية.

يوفر التصوير المماثل باستخدام مقتفٍ غير مستهدف وسيلةً للتصحيح من الامتصاص غير المتوسط بالمستقبلات. وهذا يسمح بقياس كمية ارتباط المقتف وكذلك كثافة المستقبلات في الجسم الحي بعد تطويرها. وقد ألهمت هذه التقنية باحثين آخرين لتصميم أنظمة التصوير المقطعي الفلوري الموجه بالأشعة السينية، ومهدت الطريق لتصوير الجسم بالكامل في الحيوانات الأكبر حجماً.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية إجراء تجربة التصوير المقطعي الفلوري المنتشر، والتي تجمع بين التصوير التشريحي بالأشعة السينية وأنظمة التصوير البصري لتصوير المؤشرات الحيوية للسرطان.