عزل خلايا CD4 + T من الغدد الليمفاوية باستخدام الماوس Miltenyi MACS تنقية

هذا مغناطيس Max MIDI. مكتوب عليه: تحذير، مجالات مغناطيسية قوية للغاية. مرحباً، أنا ميلاني ماثيو من مختبر مايك كولينز في جامعة كاليفورنيا إيرفاين، قسم الفسيولوجيا والفيزياء الحيوية.

سنوضح لكم اليوم كيفية تحضير خلايا T الموجبة لـ CD4 باستخدام طريقة الاختيار السلبي، وذلك باستعمال مجموعات أدوات شركة Milton Biotechnology. يتوفر لدينا هنا جهازا minimax وminimax magnets، حيث يُستخدم جهاز minimax لعمليات الفصل الأكبر حجماً، إذ يمكن تمرير ما يصل إلى 10⁹ من الخلايا عبر عمود يتناسب مع جهاز minimax، بينما يُستخدم جهاز minimax magnets لأحجام الخلايا الأصغر بكثير.

وبناءً على ما إذا كنت تقوم بعملية فصل إيجابي أو سلبي، ستقوم بوسم الخلايا باستخدام الجسم المضاد المناسب. حيث تحتوي هذه الأجسام على حبيبات مغناطيسية تلتصق بالمغناطيس. وفي حالة الانتقاء السلبي، ستمر الخلايا التي تهتم بها عبر العمود، ويمكنك حينئذٍ جمع السائل الناضح الذي سيحتوي على الخلايا المستهدفة.

يجب أن أشير إلى أن التقنيات التي أعرضها لكم الليلة ليست معقمة. لذا، إذا كنتم ترغبون في استخدام هذه الخلايا في المزارع الخلوية، فيجب القيام بكل الخطوات داخل غطاء زراعة الأنسجة باستخدام أدوات معقمة. وبالرغم من أنني أعرض لكم طريقة تحضير لخلايا T الموجبة لـ CD4، إلا أن العديد من هذه التقنيات قابلة للتطبيق في تنقية أنواع أخرى من الخلايا باستخدام مجموعات Miltenyi biotechnology.

حسناً، لقد قمت باستئصال العقد اللمفاوية من الفأر، وأوضح لكم كيفية القيام بذلك بالتفصيل في العدد السابع من JoVE بعنوان تحضير العقد اللمفاوية للتصوير ثنائي الفوتون. والآن سأقوم بطحن العقد اللمفاوية لتحويلها إلى معلق من الخلايا المفردة داخل مصفاة خلايا بمسامية 70 micron. حسناً، سأقوم الآن بطحن العقد اللمفاوية لتحويلها إلى معلق من الخلايا المفردة باستخدام الجزء الخلفي من حقنة سعة 6 mL.

توجد العقد اللمفاوية في وسط RPMI داخل مرشح، ومن المهم تحضير معلق خلوي أحادي الخلايا بشكل صحيح. والسبب في القيام بذلك داخل مرشح هو التأكد من عدم وجود أي تكتلات خلوية. لذا، عند الانتهاء من عملية الطحن، سأقوم بإخراج المرشح من الوسط ثم استخدام الخلايا التي مرت عبر المصفاة للحصول على المعلق الخلوي أحادي الخلايا.

عندما تقوم بعملية الطحن، يجب التأكد من تفتيت جميع الأنسجة قدر الإمكان. هذا المعلق من الخلايا المفردة هو ما سنقوم بتنقية الخلايا التائية الموجبة لـ CD4 منه. حسناً، لقد انتهيت الآن من طحن الأنسجة، ويمكنكم ملاحظة أن معظم العقد اللمفاوية قد تفتتت تماماً.

لا يزال لدينا بعض القطع الصغيرة من الدهون وما يشبه غلاف العقدة اللمفاوية هنا مع القليل من النسيج الضام، وكلها ملتصقة ببعضها من جميع العقد اللمفاوية الست. والآن أقوم بإزالة مصفاة الخلايا. ويمكنكم أن تروا هنا أن الوسط عكر للغاية.

إنها مليئة بالخلايا من معلق الخلية الواحدة لضمان الحصول على أكبر عدد ممكن من الخلايا من المرشح، حيث سيلتصق بعضها به. أقوم بغسلها ببضعة مليلترات من الوسط الغذائي، ثم أنقل جميع الوسط الغذائي باستخدام الماصة إلى أنبوب فالكون سعة 15 مل، وأقوم بطردها مركزياً لترسيب الخلايا من أجل التنقية اللاحقة. إليكم الآن معلق الخلية الواحدة بعد طرده مركزياً وترسيبه عند 300 G لمدة 10 دقائق.

إذا كنت تعتقد أنك ستحصل على تعداد عالٍ من الخلايا الميتة في معلق الخلايا المفردة، فمن الجيد استخدام طقم إزالة الخلايا الميتة من Milit Tene. والآن بعد أن قمت بترسيب الخلايا، سأقوم بسكب الوسط ثم إجراء تحلل لخلايا الدم الحمراء، وبعد ذلك سأقوم بعد الخلايا ثم استخدام طقم اختيار سلبي للخلايا التائية CD4 الموجبة على هذه الخلايا تحديداً. حسناً، سأقوم الآن بإجراء تحلل لخلايا الدم الحمراء (RBC lysis).

سنقوم بإجراء تحلل لخلايا الدم الحمراء التي قمنا بترسيبها مع الخلايا اللمفاوية عن طريق تقليل الاسموزية للمحلول، وذلك بإضافة الماء أولاً ثم إعادتها إلى محلول بتركيز 1x عن طريق إضافة 10X-D-B-P-S. تتميز الخلايا اللمفاوية بأنها أكثر مقاومة للتغير في الاسموزية مقارنة بخلايا الدم الحمراء، ولكن لا يزال يتعين علينا العمل بسرعة لتجنب تحلل الخلايا اللمفاوية، وهو ما نريد تفاديه. ومن ضمن خطوات العمل السريع أن أقوم بتجهيز الأحجام التي سأحتاجها لعملية التحلل قبل البدء فعلياً في إضافة الماء إلى النظام.

لذا، أريد أن أتمكن من إضافة 10 X-D-B-P-S بعد بضع ثوانٍ من إضافة الماء لضمان عدم تحلل الخلايا اللمفاوية مع ضمان تحلل خلايا الدم الحمراء. لذا، آخذ 900 µL من الماء، وهو ما يقارب 1 mL، و 100 µL من 10 X-D-B-P-S.

لقد قمت بتجهيز كلا الأنبوبين. وفي مرحلة التحلل، أضف الماء، وانتظر لبضع ثوانٍ، وربما قم برج الأنبوب قليلاً، ثم أضف 10 X-D-B-P-S، وقم برج الأنبوب مرة أخرى. وإذا كنت تقوم بتحليل عدد كبير من خلايا الدم الحمراء، فسترى تشكل كتلة غير متبلورة كبيرة ناتجة عن جميع أغشية الخلايا الممزقة.

لدينا كمية قليلة هنا، ويمكنكم أن تروا أنها عبارة عن أغشية خلوية ممزقة جزئياً. لذا، بعد إتمام عملية التحلل، وتحسباً لوقوع أي خطأ في عملية النقل بالماصة، أفضل إضافة بضعة ملي لترات من الوسط الغذائي إلى الخلايا للتأكد من أن الأسمولية صحيحة ولضمان عدم استمرار عملية التحلل بشكل أكبر. حسناً، الآن أصبحت الخلايا اللمفاوية لدي في حالة تعليق خلوي مفرد.

مرة أخرى، لقد قمت بعملية تحلل خلايا الدم الحمراء، وسأقوم الآن بطردها مركزياً لترسيبها. قبل القيام بذلك، سأقوم بعدّها باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer) لتحديد كمية الأجسام المضادة التي نحتاج إلى إضافتها لطقم الاختيار السلبي للخلايا التائية الموجبة لـ CD four. حسناً، الآن أقوم بطرد الخلايا مركزياً في محلول max buffer، ويمكنكم ملاحظة أن الراسب أصبح أكثر بياضاً بعد أن أجرينا عملية تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC lysis).

وسأقوم بإجراء اختيار سلبي للخلايا التائية CD4 الموجبة. لذا، سأقوم بسكب كل الوسط، وجميع محلول max buffer الذي استخدمته لترسيب الخلايا. ثم سأقوم بالوسم باستخدام كوكتيل أجسام مضادة مرتبطة بالبيوتين، وهي الخطوة الأولى في عملية الاختيار السلبي للخلايا التائية CD4 الموجبة.

ثم أقوم بالتحضين في الثلاجة لمدة 10 دقائق. حسناً، لقد انتهت الخلايا من مرحلة التحضين الأولية. سأقوم الآن بإضافة المضاد الحيوي إلى الحبيبات الدقيقة (microbeads) وإعادتها إلى الثلاجة لمدة 15 دقيقة.

بالنسبة لعملية فصل الخلايا هذه، سنستخدم عمود LS من شركة Miltenyi Biotec، وما سنقوم به هو وضعه على الحامل المغناطيسي وتجهيز العمود بتمرير 3 mL من منظم MAC عبره؛ سنقوم بفتح العمود ووضعه بحيث تكون الأسنان موجهة للداخل نحو المغناطيس. سأقوم الآن بإضافة منظم MAC إلى العمود، ويجب أن تلاحظ تدفقه عبر عمود LS وبدء تقاطره من الأسفل. لا داعي للقلق من جفاف العمود.

سيمنع التوتر السطحي للسائل جفاف العمود حتى تقوم بإضافة الخلايا. ومن المهم، قبل إضافة الخلايا، السماح للمحلول المنظم (max buffer) بالنفاذ تماماً عبر العمود. حسناً، بعد فترة تحضين لمدة 15 دقيقة باستخدام حبيبات البيوتين المغناطيسية المضافة إلى الخلايا والمحلول المنظم (max buffer)، سأقوم بسكب المحلول المنظم، ثم إعادة تعليق الخلايا في كمية من المحلول المنظم تتناسب مع عدد الخلايا لدينا.

لذا سيتعين عليك مراجعة بروتوكول milli tiny الخاص بذلك. ومن ثم سأقوم بتطبيقها على العمود الذي شطفناه للتو باستخدام max buffer. والآن سنضيف معلق الخلايا إلى العمود.

وبما أن هذا العمود مخصص للاختيار السلبي، فسنقوم بجمع الخلايا التي تدفقت من خلاله، والتي يجب أن تكون جميعها خلايا T موجبة لـ CD4 في هذه الحالة. والآن سأقوم بغسل العمود بـ 12 mils من منظم max، ومرة أخرى، سنقوم بجمع السائل المستخلص، والذي يجب أن يحتوي فقط على خلايا T موجبة لـ CD4. والآن سأقوم بتدوير خلايا T موجبة لـ CD4 بسرعة عالية لترسيبها، ثم إعادة تعليقها، وبعد ذلك وسمها بالصبغة المناسبة التي سأستخدمها لتصوير tau.

سأقوم أيضاً بأخذ عينة صغيرة من الخلايا التي نقيتها ووسمها باستخدام anti CD three و anti CD four، ثم تحليلها بواسطة جهاز FACS للتأكد من حصولي على مجموعة نقية من الخلايا التائية CD4 positive. إليكم نظرة على الخلايا التي قمنا بتدويرها مركزياً للتو؛ من المفترض أن تكون هذه مجموعة نقية من الخلايا التائية CD three و CD four positive.

لقد عرضتُ لكم للتو عملية الانتخاب السلبي للخلايا التائية الموجبة لـ CD4. وباستخدام مجموعة أدوات Miltenyi Biotec، سنقوم بنقل هذه الخلايا تكييفياً إلى فأر، ومن ثم استخدامه في إحدى تجارب T-PHOTON الخاصة بنا. حظاً موفقاً في تجاربكم الخاصة.