Nanotopology من التصاق الخلايا على متغيرة الزوايا الداخلية انعكاس إجمالي مضان المجهري (VA-TIRFM)

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس تضاريس التصاق الخلايا على ركيزة بدقة نانومترية. ويتم تحقيق ذلك من خلال زراعة الخلايا أولاً على شرائح زجاجية شفافة وتحضينها مع وسم فلوري. بعد ذلك، يتم معايرة الموضع الزاوي للمرآة القابلة للتعديل في المجهر وتخزين هذا الموضع في برنامج تحديد موقع المرآة.

تتمثل الخطوة التالية في تسجيل صور الفلوريسنت عند التشعيع بزوايا مختلفة تبلغ حوالي 10 زوايا. وتتمثل الخطوة النهائية في حساب المسافات بين الخلية والركيزة بدقة تصل إلى بضعة نانومترات. وفي النهاية، تُستخدم نتائج طوبولوجيا التصاق الخلايا على الركيزة لإظهار الاختلافات في الالتصاق بين الخطوط الخلوية المختلفة، على سبيل المثال، الخلايا السرطانية والخلايا الأقل خباثة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل المجهر البؤري (confocal microscopy)، في أن الدقة الفعلية تقع في نطاق بضع نانومترات فقط. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول الأغشية الخلوية، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى مثل الحويصلات الصغيرة أو المواد النانوية.

ستقوم الباحثة في مرحلة ما بعد الدكتوراه، Petra، بتوضيح التجربة من خلال تحضير عينات الخلايا، بينما سيتولى المهندس Michael Wagner تشغيل التجربة. لتحضير الخلايا لفحص المجهر الفلوري ذو الزاوية المتغيرة والانعكاس الداخلي الكلي، يتم استزراع خلايا فردية بكثافة 100 cells per square millimeter على شريحة زجاجية في وسط استزراع مضاف إليه 10% fetal calf serum ومضادات حيوية. تُنمى الخلايا لمدة 72 hours في حاضنة عند 37 °C و 5% carbon dioxide.

بعد ذلك، يتم تطبيق الغشاء الفلوري على الخلايا، وهو الواصم 6-DAPI، أو decano 2، dimethyl amino naphthalene، أو lorane بتركيز 8 µM في وسط الزرع، ثم تُحضن الخلايا لمدة 60 دقيقة قبل إجراء المجهر الفلوري. تُغسل الخلايا باستخدام PBS، حيث يتم نقل المحلول المنظم بواسطة الماصة فوق الشريحة لغسل الوسط، وبعد ذلك، يُمسح المحلول المنظم من الجهة الخلفية للشريحة. يُستخدم مجهر رأسي مثل Zeiss Axio plan، مجهز بإضاءة خلفية وكاميرا exon E-M-C-C-D للتصوير بزوايا متغيرة.

يتم استبدال المكثف في مجهر T-I-R-F-M بجهاز إضاءة مصنع خصيصاً يتكون من منشور زجاجي نصف أسطواني مقترن بصرياً بشريحة العينة. يسقط شعاع الليزر من ليف بصري أحادي النمط موازٍ، والذي يؤدي بعد تصويره بواسطة المنشور الزجاجي ومكونات بصرية إضافية إلى تكوين شعاع موازٍ مرة أخرى على سطح العينة. يجب التأكد من أن متجه المجال الكهربائي مستقطب وبشكل عمودي على مستوى السقوط.

يتم تحديد هذا الموضع على قارن المخرجات الخاص بالألياف. استخدم مرآة قابلة للتعديل تقع داخل المكثف، والتي يتم تصويرها في مستوى العينة وتضيء العينة تحت زاوية سقوط متغيرة أو شعاع جسم. يمكن تشغيل المرآة القابلة للتعديل بواسطة محرك خطوي يتم التحكم فيه عن طريق برنامج.

تتوافق كل وضعية مع زاوية سقوط محددة بدقة بناءً على القياسات التي أجريت بواسطة مقياس go. ولمعايرة الوضع الزاوي للمرآة القابلة للتعديل، استخدم صبغة فلورية مثل فلافين نوكليوتيد بتركيز 1 mM، مذابة في الماء. ولتحديد الزاوية الحرجة عند تغيير زاوية السقوط، استخدم الزاوية الحرجة البالغة 61.3 درجة لانتقال الزجاج-الماء كقيمة ثابتة، ويتم تخزين الوضع الزاوي للمرآة الذي تتساوى عنده زاوية السقوط مع الزاوية الحرجة في برنامج تحديد وضعية المرآة.

باستخدام برنامج الكاميرا، قم بضبط معلمات كاميرا E-M-C-C-D، بما في ذلك كسب درجة الحرارة، ووقت التسجيل، وسرعة الإزاحة. استخدم زيت الغمر لضمان التلامس البصري للعينة. وباستخدام منشور زجاجي، اختر عدسة شيئية ذات تكبير مناسب للخلايا وفتحة عددية متوسطة.

لتصور الجسم في المجهر، استخدم مرشح تمرير طويل أو مرشح تمرير نطاق مناسب للكشف عن الفلورة. سجل صور الفلورة لعينات متماثلة عند تغيير زاوية الإضاءة. يجب أن تكون زوايا السقوط مساوية للزاوية الحرجة أو أكبر منها.

بما أن الزاوية الحرجة المقابلة لواجهة الخلية والزجاج تبلغ 64.5 درجة، يُوصى بنطاق زاوي يتراوح من 66 درجة إلى 74 درجة وبخطوات قدرها 0.5 درجة أو درجة واحدة. لبدء تحليل البيانات، استخدم برنامج lab view لقراءة الصور المسجلة عند زوايا مختلفة، بالإضافة إلى إعدادات الكاميرا، وطول موجة الإثارة، ومعاملات الانكسار. يتم استيراد الإعدادات الخاصة بالزجاج، والتي تبلغ 1.52، والخلايا، والتي تبلغ 1.37، وذلك لتقييم البيانات بشكل صحيح.

بالنسبة لكل مجموعة من المعاملات، يتم حساب عمق الاختراق وعامل النفاذية تلقائياً. ولضمان نجاح الإجراء، من المهم تسجيل الصور بعناية واختيارها للتحليل. اختر الصور المستخدمة لتقييم المسافات بين الخلايا والركيزة وفقاً للمعادلة.

بالنسبة لعلامة الغشاء، يمكن استبعاد الصور الفردية ذات الإضاءة المتجانسة، كما هو موضح في هذا المثال. قم بحساب صور تضاريس الركيزة الخلوية واختر رمزًا لونيًا مناسبًا للعرض أثناء التقييم. يمكن عرض مقاطع بكسلات فردية كما هو مصور في هذا الشكل.

يمكن استخدام هذه المقاطع كمؤشر لجودة الملاءمة. وأخيرًا، قم بحفظ بروتوكول التقييم. يوضح هذا الشكل صور الانعكاس الداخلي الكلي لخلايا الورم الأرومي الدبقي U2 51 التي تحتوي على جين TP 53 كابت للأورام في حالة نشطة.

عند التحضين مع luan والتسجيل عند زوايا سقوط مختلفة، حيث تقابل الزاوية 66 درجة عمق اختراق للمجال الكهرومغناطيسي المتلاشي يبلغ حوالي 140 nanometers، والزاوية 69 درجة عمق اختراق يبلغ 75 nanometers، والزاوية 73 درجة عمق اختراق يبلغ 60 nanometers مع تناقص عمق الاختراق. تنخفض شدة التألق وتصدر من مواقع أكثر سطحية في الخلايا، مثل نقاط التلامس البؤرية على حوافها. وتظهر المسافات بين الخلايا والركيزة في اللوحة D من خلال رمز لوني يتراوح من صفر إلى 600 nanometers كما هو موضح هنا.

تتفاوت المسافات بين الخلايا والركيزة بشكل كبير عبر الخلايا، حيث تتراوح بين بضعة نانومترات فقط، والتي يمثلها اللون الأبيض إلى الأصفر، وبين 250 إلى 300 نانومتر، والتي يمثلها اللون الأحمر الداكن. ويشير هذا إلى أن الاتصالات البؤرية والمسافات الأكبر بين الخلايا والركيزة تقع في جوار وثيق. وقد تم حساب تباين مماثل في المسافات بين الخلايا والركيزة لخلايا الورم الأرومي الدبقي U2 51 mg مع تفعيل الجين الكابت للأورام P 10.

وفي المقابل، كانت المسافات بين الخلايا والركيزة ثابتة إلى حد كبير بالنسبة لخلايا التحكم U2 51 mg الممثلة باللون الأصفر، والخلايا البرية الممثلة بالتدرج من البرتقالي إلى الأحمر بعد تطورها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال طبوغرافيا الركيزة الخلوية لاستكشاف الخلايا الورمية والتغيرات المورفولوجية الناتجة عن العلاج بالليزر. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية تصور الأسطح بدقة فعلية في نطاق النانومتر مع التعرض لضوء منخفض، وهو أمر تتحمله الكائنات الحية بشكل جيد.