على نطاق صغير مقتطفات النووية لفحوصات وظيفي من الجينات التعبير عن مكائن

الهدف العام من التجربة التالية هو قياس التعبير الجيني باستخدام الآليات النووية الوظيفية المستخلصة من الخلايا. ويتحقق ذلك أولاً عن طريق حصاد خلايا HeLa من خلال عملية التوريم. بعد ذلك، يتم تكسير الخلايا بالتحليل الميكانيكي، ثم تُطرد مركزياً في الخطوة الثالثة لترسيب النوى.

يتم استخلاص النوى بالملح، وتركيزها، وديلزتها (عملية الديلزة) من أجل الحصول على آليات تعبير جيني ذائبة ووظيفية. وفي النهاية، يمكن تقييم فاعلية المستخلصات النووية بناءً على أنشطة النسخ والربط الخاصة بها، والتي يتم تقديرها باستخدام نظام مقترن يربط إنزيم RNA polymerase بعمليتي النسخ والربط. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تحضير المستخلص النووي الشامل، في إمكانية استخدام كمية صغيرة من الخلايا لتحضير المستخلص النووي.

ابدأ بزراعة خلايا hela في ثلاث أطباق قطرها 150 مليمتر باستخدام وسط DMEM المكمل بـ FBS والمضادات الحيوية، ثم قم بتنمية المزارع في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C مع 5%CO2 حتى تصل الخلايا إلى 90%Co من درجة الالتحام. عند هذه النقطة، اسحب الوسط من مزارع خلايا HELOC واغسلها مرة واحدة بـ 13 مليلتر من PBS بدرجة حرارة الغرفة لكل طبق، ثم اسحب PBS. ضع كل طبق على جانبه لبضع ثوانٍ، ثم اسحب ما تبقى من PBS.

بعد ذلك، استخدم رافعة خلايا لكشط الخلايا نحو الحافة السفلية لكل طبق، ثم اسحب الخلايا إلى أنبوب إينور سعة 1.5 milliliter. وأخيراً، قم بترسيب الخلايا في جهاز طرد مركزي دقيق لمدة خمس دقائق عند 100×g وبدرجة حرارة 4 °C. الآن، اشفط محلول PBS من كتلة الخلايا المترسبة وقم بتقدير حجم الخلايا المكدسة أو PCV من خلال النظر إلى تدريج الأنبوب.

ثم أضف إلى كتلة الخلايا المترسبة حجماً من المنظم منخفض التوتر يعادل ضعف حجم PCV. رج الأنبوب بلطف لإعادة التعليق. يتم تفكيك تجمعات الخلايا، حسب الضرورة، عن طريق سحب معلق الخلايا ودفعه بلطف باستخدام ماصة سعة 1000 microliter.

بعد ذلك، قم بترسيب الخلايا تحت نفس ظروف الطرد المركزي السابقة. بعد عملية الطرد المركزي، قم بسحب طبقة المحلول المنظم منخفض التوتر بعناية. ستكون الخلايا قد بدأت في الانتفاخ وسيزداد حجم الخلايا إلى حوالي 750 إلى 1000 microliters.

أضف محلولاً منظماً منخفض التوتر الجديد حتى يصل الحجم النهائي إلى 1.5 milliliters، ثم أعد تعليق الخلايا في المحلول المنظم. وأخيراً، قم بحضن الخلايا المنتفخة المعاد تعليقها على الثلج لمدة 10 دقائق حتى تبرد الخلايا. اشطف جهاز التجانس (homogenizer) بمحلول منظم منخفض التوتر، ثم ضعه على الثلج مع الخلايا.

ثم باستخدام ماسحة دقيقة للمهام مثل Kim wipe، جفف المادقة. استخدم طرف ماصة دقيقة ممتد سعة 1000 µL لإزالة المحلول المنظم من الأنبوب. الآن استخدم الماصة لنقل الخلايا المتورمة المبردة إلى داخل الأنبوب.

إن الجزء الأكثر دقة في هذا الإجراء لضمان النجاح هو التحقق من حدوث التحلل. بعد كل مرحلة من مراحل السحق تحت المجهر، حرك المدقة بإبطاء للأعلى وللأسفل خمس مرات لتحليل الخلايا، مع الحرص على تجنب تكون الفقاعات. بعد ذلك، انقل 5 µL من معلق الخلايا المتحللة إلى أنبوب إبيدور وأضف 10 µL من صبغة تريبان الزرقاء و 15 µL من 1X PBS.

أضف محلول الخلايا إلى شريحة وافحص الخلايا تحت مجهر ضوئي للتحقق من التحلل، حيث ستظهر نويات الخلايا المتحللة باللون الأزرق بعد ثلاث أونصات. لا يوجد تحلل كافٍ نظراً لوجود العديد من الخلايا الحية المرئية. بعد خمس أونصات، يصبح التحلل كافياً.

أخيراً، انقل الخلايا المحللة إلى أنبوب "إينور" المبرد مسبقاً، وقم بطرد معلق الخلايا مركزياً لمدة خمس دقائق في جهاز طرد مركزي دقيق عند 1500 ×g ودرجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، انقل السائل الطافي بعناية إلى أنبوب جديد دون تعكير الراسب. الآن، قم بتقدير حجم النواة المرقعة (PNV) من خلال النظر إلى التدريجات الموجودة على الأنبوب.

املأ رأس الماصة الدقيقة بمحلول منظم منخفض الملوحة بكمية تعادل نصف حجم النواة (PNV). ثم أدخل رأس الماصة الدقيقة في النوى الموجودة في قاع أنبوب إينور. قم بحقن المحلول المنظم ببطء داخل النوى مع الخلط برفق.

قم بالنقر برفق على الأنبوب للتأكد من إعادة تعليق الراسب تماماً. بعد ذلك، أضف منظم ملحي عالي التركيز بمقدار نصف حجم الـ PNV، وامزجه بسرعة لمرة واحدة عن طريق قلب الأنبوب. قم بتدوير الأنبوب لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C.

أخيرًا، قم بتدوير النوى في جهاز الطرد المركزي الدقيق لمدة 15 دقيقة عند 18,000 ×g ودرجة حرارة 4 °C. ابدأ بنقل 500 µL من السائل الطافي إلى أنابيب تركيز دقيقة مبردة. قم بتدوير مستخلص النوى عالي الملوحة لمدة 15 دقيقة عند 14,000 ×g ودرجة حرارة 4 °C، وبعد عملية الطرد المركزي، اقلب أنبوب التركيز الصغير وضعه في أنبوب EPR فردي جديد.

بعد الطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 1000 ×g ودرجة حرارة 4 درجات مئوية، سيتم تركيز المستخلص النووي عالي الملوحة إلى ما يقرب من 115 µL. الآن، انقل حصصاً قدرها 45 µL من المستخلص النووي عالي الملوحة إلى شرائح الديلزة الصغيرة (mini dialysis SLIs). تأكد من ملامسة الجزء السفلي من الشريحة لقاع العوامة.

بعد ذلك، ضع شرائح الانزلاق (SLIs) في 500 milliliters من محلول الديلزة المبرد. وأخيرًا، قم بتقليب الأجزاء لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعتين عند درجة حرارة 4 °C؛ حيث سيظهر المستخلص النووي عكرًا بعد عملية الديلزة. يوضح هذا الشكل بيانات تمثيلية تقارن بين تفاعل نسخ وتقطيع مقترن بواسطة RNA polymerase two في مستخلص نووي صغير الحجم مقابل مستخلص نووي بكمية كبيرة.

عندما تم تحضين بنية A-C-M-V-D-N-A في المستخلصات واسعة النطاق أو صغيرة النطاق، تم تصنيع مستويات مماثلة من pre mRNA الناشئ بحلول النقطة الزمنية خمس دقائق؛ وبعد إضافة alpha و manin لمنع المزيد من النسخ، تراكمت نواتج الربط والوسطاء المرحلية للربط بمرور الوقت بحركية مماثلة في كلا النوعين من المستخلصات. تؤكد هذه النتائج التمثيلية أن كفاءات نظام النسخ والربط المقترن بواسطة RNA polymerase two متماثلة في المستخلصات النووية واسعة النطاق وصغيرة النطاق. ولإثبات فائدة المستخلص صغير النطاق، تم تحضير مستخلصات بطريقة معينة من خلايا hela المعالجة بمثبط الربط E 7 1 0 7 أو مركب التحكم السلبي Platy analy F، ثم أُجري مقايسة النسخ والربط المقترن بواسطة RNA polymerase two كما هو موضح في هذا الشكل؛ وقد حدث النسخ بواسطة RNA polymerase two بكفاءة في المستخلصات المحضرة من الخلايا المعالجة بكل من plaid F و E 7 1 0 7.

وفي المقابل، حدث الربط (splicing) بشكل طبيعي في المستخلص المُحضّر من الخلايا المعالجة بـ analy F، ولكنه توقف تماماً في الخلايا المعالجة بـ E 7 1 0 7. وتوفر هذه البيانات إثباتاً للمفهوم حول استخدام المستخلصات النووية صغيرة الحجم لمعالجة الخلايا بشكل خاص على نطاق صغير. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في أقل من خمس ساعات.