Microdialysis من الإيثانول خلال فعال الإيثانول الإدارة الذاتية والايثانول تقرير بواسطة جهاز الكروماتوجرافي الغازي

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة مستويات الإيثانول في نضحي الدماغ أثناء جلسة الإدارة الذاتية للإيثانول. ومن أجل مقارنة هذا القياس بسلوكيات الإدارة الذاتية المتزامنة، يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق زرع دليل الديلزة الدقيقة وقنية ومسمار الربط جراحياً، ثم تدريب الجرذان على الإدارة الذاتية للإيثانول إجرائياً. وتتمثل الخطوة الثانية في تعويد الجرذان على رباط مرحلة الرأس بحيث لا يعيق الإدارة الذاتية للإيثانول أثناء الديلزة الدقيقة.

بعد ذلك، يتم إجراء الديلزة الغشائية الدقيقة أثناء جلسة الإدارة الذاتية للإيثانول، حيث يتم تحضير جزء من السائل الديلزي لتحليل الإيثانول. تالياً، يتم تحليل عينات السائل الديلزي لتحديد تركيز الإيثانول باستخدام كروماتوغرافيا الغاز مع كاشف التأين باللهب. وفي النهاية، تُظهر النتائج التي تم الحصول عليها المسار الزمني لوصول الإيثانول إلى منطقة الدماغ المستهدفة خلال جلسة الإدارة الذاتية للإيثانول.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل ثقب الذيل أو الوريد الصافن، في أن هذا الإجراء يسبب أدنى حد من الاضطراب أثناء جمع العينة، ويسمح بقياس الدواء بمرور الوقت في منطقة الدماغ المستهدفة بينما يقوم الحيوان بأداء مهمة سلوكية. وبشكل عام، قد يواجه المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة لأنها تتطلب عدداً من المهارات المتخصصة، والتي لا يمكن اكتساب الكثير منها إلا من خلال الممارسة المتكررة أو الخبرة. وسيقوم جيفري ديلي، وهو مساعد بحث في مرحلة البكالوريوس في مختبرنا، بتوضيح الإجراء.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية الموضحة من قبل لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسي للحيوان بجامعة تكساس، وهي تتبع جميع لوائح دليل الرعاية والاستخدام للحيوانات المختبرية. تُعد جامعة تكساس في أوستن مرفقاً معتمداً من قبل ALAC، وقد تم استخدام جرذان لونج إيفانز (Long Evans) خضعت لمعاملة دقيقة وتم زرع كانيولا مقاس 21 جج جراحياً فوق منطقة الدماغ المستهدفة من أجل تجارب الدياليز الدقيق السلوكية هذه. يجب أن تتلقى جميع الحيوانات رعاية وتعافياً لما بعد الجراحة لمدة أسبوع واحد على الأقل، وأن تكون بصحة جيدة قبل البدء في الإجراءات التالية.

ضع الجرذ في غرفة تشغيل من شركة med associates، مجهزة بذراع لichter قابلة للسحب وأنبوب tipper، وقم بتدريبه على الضغط على الذراع للحصول على محلول سكروز بتركيز 10%. بعد تدريب الجرذ على الاستجابة للحصول على محلول السكروز، ابدأ بتطبيق جدول تدريبي مناسب يتم خلاله إضافة الإيثانول تدريجياً إلى المحلول على مدار عدة جلسات شرب في الليلة التي تسبق الجلسة التشغيلية قبل الأخيرة. بعد تخدير الحيوان والتحقق من مستوى التهدئة، قم بتوصيل زنبرك الربط ببرغي الربط الموجود في المرحلة الرأسية للجرذ لتعويده على الجهاز الذي يتكون من ذراع موازنة، وذراع، ورباط دوار، وزنبرك، وحامل حلقات.

يُترك الجرذ ليمضي الليل في غرفة التكييف الإجرائي (operant room) داخل قفصه المنزلي مع توفير الإضاءة والغذاء والماء، ثم تُستكمل جلسة تدريب اليوم التالي باستخدام القيد والمعدات الملحقة في اليوم السابق لتجربة الديلزة الدقيقة (microdialysis). بعد تخدير الجرذ باستخدام isof fluorine، يتم التحقق من درجة التخدير عن طريق قرص الإصبع، ثم يتم إدخال مسبار الديلزة الدقيقة المروى بسائل نخاعي شوكي اصطناعي. يتم تثبيت المسبار بشكل مناسب، ثم يُضبط معدل تدفق المسبار على 0.2 microliters per minute.

ضع الجرذ في قفصه المنزلي داخل غرفة التشغيل ليمضي الليل مع تثبيت كافة معدات الدياليز (الديال) وتوفير الطعام والماء بشكل حر. في اليوم التالي لعملية إدخال المسبار، وقبل بدء التجربة بساعتين على الأقل، ارفع معدل تدفق المسبار إلى معدل التدفق التشغيلي. وباستخدام حقنة Hamilton، تحقق من أن معدل تدفق المسبار ثابت وبنسبة لا تقل عن 90% من معدل التدفق المحدد.

إذا كنت تقوم بتقييم الناقلات العصبية في عينات الديلزة، فقم بأخذ العينات خلال جميع مراحل التجربة. ابدأ بجمع عينات الديلزة بينما يكون الحيوان في قفصه المنزلي. قم بتخزين العينات بطريقة مناسبة للتحليل اللاحق.

انقل الجرذ بعناية إلى غرفة التشغيل وبدأ برنامج التشغيل الذي يتحكم في الغرفة. استمر في أخذ العينات بينما ينتظر الجرذ امتداد الرافعة إلى داخل الغرفة، بحيث يتم أخذ عينتين قبل امتداد الرافعة. ابدأ في جمع جزء من كل عينة من ناتج الديلزة لتحليل الإيثانول عن طريق سحب كمية مناسبة من ناتج الديلزة باستخدام الماصة ووضعها في قارورة زجاجية سعة 2 مل، ثم أغلق القارورة بسدادة محكمة الإغلاق، وقم بسحب وعزل عينات الإيثانول بسرعة.

نظرًا لأن الإيثانول مادة متطايرة وحجم العينة صغير، فإن التحضير غير المتسق أو البطيء للعينة سيؤدي إلى نتائج غير دقيقة. احفظ المتبقي لتحليل الناقلات العصبية. تبدأ فترة الشرب التي تستغرق 20 دقيقة بعد أن يقوم برنامج كمبيوتر Med Associates بتمديد الرافعة داخل الغرفة ويضغط عليها الجرذ للوصول إلى زجاجة محلول الشرب.

استمر في أخذ العينات طوال فترة الشرب بأكملها، وبعد انتهاء فترة الشرب، يقوم البرنامج الحاسوبي بسحب الزجاجة من الغرفة. احتفظ بالحيوان في الغرفة لمدة 20 minute إضافية في فترة ما بعد الشرب عند نهاية تجربة الديلزة الغشائية الدقيقة. بعد تخدير الجرذ، قم بإزالة المسبار.

إذا لم يتم إجراء القتل الرحيم للحيوان على الفور وبطريقة إنسانية، فقم بإعادة تركيب السداد لضمان رؤية مسار المسبار. قم بجمع الدماغ في غضون ثلاثة أيام من التجربة. حلل العينات مع معايير إيثانول خارجية باستخدام كروماتوغرافيا الغاز المزودة بكاشف تأين اللهب، وجهاز أخذ عينات تلقائي للمساحة الرأسية (headspace autosampler) مُسخن إلى 50 °C، وعمود شعري باستخدام الهيليوم كطور متحرك.

لتسجيل الكروماتوغرامات وتحليلها، استخدم برنامج محطة عمل الكروماتوغرافيا لتهيئة النظام لتحليل الإيثانول. استخدم حماماً مائياً دواراً لتسخين صفيحة أخذ العينات التلقائي وافتح خزانات الهواء والهيدروجين. بعد ذلك، ابدأ برنامج التشغيل.

عندما يصبح الجهاز جاهزاً، ابدأ عملية الحرق لمدة 20 دقيقة، مما يؤدي إلى تطهير الليف. قم بتحضير المحاليل القياسية باستخدام دورق قياسي سعة 100 milliliter لتخفيف 238 µL من ethanol بتركيز 95% بالماء حتى يصل الحجم النهائي إلى 100 milliliter. استخدم التخفيف التسلسلي بنسبة واحد إلى واحد لتحضير المحاليل القياسية.

انقل المحاليل القياسية باستخدام الماصة إلى قوارير زجاجية وأغلقها تماماً كما تم تحضير العينات. تأكد من تشغيل عينة ضابطة من الماء (water blank) جنباً إلى جنب مع المحاليل القياسية. ضع المحاليل القياسية والعينات في صينية جهاز أخذ العينات التلقائي (autosampler)، وسخنها حتى يتم تبخير كامل الحصة السائلة.

لتشغيل المعايير والعينات، قم بإنشاء قائمة عينات توضح مكان كل عينة في فتحات جهاز سحب العينات التلقائي، مع ملاحظة وجوب ثقب كل عينة. بمجرد توجيه ملفات البيانات إلى مجلد محدد، اختر الطريقة المناسبة للعينات وابدأ التشغيل. بعد انتهاء النظام من تحليل العينات، تحقق من أن البرنامج قد قام بتكامل كل قمة بشكل صحيح.

قم برسم ارتفاع القمة كدالة لكل معيار خارجي معروف. تركيز الإيثانول. استخدم الدالة الخطية الناتجة عن هذه النقاط لاستكمال تركيز الإيثانول في كل عينة من نواتج الديلزة.

يوضح هذا الشكل نماذج من الكروماتوجرامات لثلاثة تركيزات من معايير الإيثانول، ونموذجاً واحداً لعينة من نضحيات جرذ تم جمعها في نهاية جلسة الإدارة الذاتية للإيثانول. يجب أن تكون قمم الإيثانول متماثلة نسبياً، وذات أزمنة استبقاء متسقة، ونسبة إشارة إلى ضجيج أكبر من 10. ويشير عدم استيفاء هذه المعايير إلى أن النظام يتطلب صيانة؛ حيث ينتج عن الكروماتوجرافيا عالية الجودة والمعايير الصحيحة منحنى قياسي خطي يُستخدم لحساب تركيز الإيثانول في عينات النضحيات التي جُمعت من الحيوانات التي تدير الإيثانول ذاتياً على مدار فترة الإدارة الذاتية.

إن تركيزات الإيثانول المستمدة من سائل الديلزة غير مصححة وفقاً لاسترداد المسبار في الجسم الحي، وهي لا تمثل سوى جزء بسيط من تركيز الإيثانول في أنسجة الدماغ. وفي حال تطلب الأمر إجراء تحليل كمي للإيثانول عن طريق الديلزة الدقيقة، يتم تحديد كسر استخلاص الإيثانول الذي ينتشر من الحيز خارج الخلوي إلى المسبار تجريبياً. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون أربع إلى خمس ساعات تقريباً إذا نُفذت بشكل صحيح.

سيختلف هذا بناءً على طول الجلسة السلوكية. يعتمد الإكمال الناجح لمرحلة الديلزة الدقيقة (microdialysis) في التجربة بشكل كبير على جودة المراحل التحضيرية. ومن المهم محاولة تنفيذ هذا الإجراء لضمان التعامل الجيد مع الجرذان وتعويدها على أي محفزات تشتت محتملة قد تحدث أثناء تجربة الديلزة، وذلك لضمان عدم تأثر سلوك الإدارة الذاتية لدى الحيوان.