تحسين التصور الانبثاث الرئة في قرار خلية واحدة في الفئران عن طريق الجمع بين

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحسين الكشف عن النقائل المجهرية في رئة الفأر خارج الجسم (ex vivo) مع الحفاظ على بنية الرئتين المنتفختين. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تروية الرئة في موقعها (in situ) باستخدام PBS لإزالة الدم، والذي يعد المصدر الرئيسي للخلفية الملونة في هذا النسيج. تتمثل الخطوات التالية في نفخ الرئة عن طريق حقن PFA، ثم الربط لتثبيت نسيج الرئة تحت حالة النفخ.

بعد ذلك، يتم إزالة الرئة وتثبيتها بشكل إضافي في PFA أو يتم تضمين فصوص رئة منفردة لعمل مقاطع تجميدية. وتتمثل الخطوات النهائية في صبغ الأنسجة بمحلول Xal وتصوير خلايا ورم LA zag؛ وفي النهاية، يمكن الكشف عن النقائل في فصوص الرئة الكاملة أو في مقاطع أنسجة الرئة وصولاً إلى مستوى الخلية الواحدة باستخدام مجهر ثنائي العينين أو مجهر ضوئي. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تقنية sky القائمة بذاتها، في أن القدرة على اكتشاف النقائل الدقيقة تتحسن بشكل ملحوظ نتيجة إزالة الخلفية المرتبطة بالدم.

ابدأ البروتوكول بتخدير الفأر عن طريق حقن داخل الصفاق بمزيج من الكيتامين والزيلازين والأسبرومازين في 150 µL تقريباً من PBS. وعندما تتوقف ردود الفعل المؤلمة لدى الفأر، قم بتثبيته على طاولة العمليات. ثم قم بإزاحة الشعر في منطقة الظهر وتمليسه باستخدام ethanol بتركيز 70%.

افتح الجلد من البطن وصولاً إلى الرقبة. اسحب الجلد إلى الجانبين أو قم بإزالته. افتح البريتون في الصدر بعناية لمنع تمزق الأوعية الكبيرة مثل الأوردة الوداجية.

سيعمل ذلك على تحسين كفاءة عملية التروية. الآن، قم بقطع الوريد الأجوف السفلي تحت الكبد باستخدام حقنة سعة 20 milliliter بإبرة مقاس 21 إلى 24 gauge. احقن ببطء من 10 إلى 15 milliliters من PBS في البطين الأيمن للقلب وهو ينبض حتى يصبح الرئة بيضاء تماماً ويتوقف القلب عن النبض.

بعد ذلك، قم بسد الأوعية الدموية فوق الكبد والحجاب الحاجز باستخدام مشبك وعائي. املأ محقنة سعة 10 مل من مادة paraform aldehyde بتركيز 3%، وباستخدام إبرة بقياس 21 إلى 24، قم بالحقن في البطين الأيمن. كمية تقريبية تبلغ 2 مل.

اكشف عن الرغامى خارج التجويف الصدري وانفخ الرئة عن طريق حقن حوالي ثلاثة ملليلتر من الألدهيد في الرغامى من خارج التجويف الصدري. ثم مباشرة بعد إزالة الإبرة، أغلق الرغامى عند نقطة الثقب باستخدام مشبك وعائي وانتظر لمدة 10 دقائق للسماح بالتثبيت. بعد ذلك، اقطع الأوعية الدموية الموجودة فوق المشبك الوعائي.

بعد ذلك، قم بإزالة الملقط وحقن حوالي 2 mL من PBS في البطين الأيمن لإزالة الفائض من الفورمالديهايد. قم بثقب الأجزاء السفلية من جميع فصوص الرئة باستخدام إبرة، ثم قم بإزالة الملقط الوعائي من الرغامي. الآن، احقن من 3 إلى 5 mL من محلول التضمين المخفف في الرغامي بالتزامن مع عملية الحقن الأخرى.

أوقف عملية الحقن عندما يحل المحلول محل البارافورم الموجود في فصوص الرئة. قم بإزالة الرئة بعناية عن طريق سحب القلب بملقط وقطع الأربطة النسيجية الضامة، والأوعية الدموية، والقصبة الهوائية. تأكد من إبقاء القلب متصلاً بالرئتين.

اعزل فصاً واحداً لعمل مقاطع تجميدية (cryo sections)، واستخدم بقية أنسجة الرئة لعمل صبغ للرئة كاملة. ضع الرئة في كوب بلاستيكي ذي غطاء محكم الإغلاق وثبتها باستخدام 2% formaldehyde وPBS. ضع قطعة من الشاش فوق الرئة لإبقائها مغمورة في المحلول، واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

بعد مرور نصف ساعة، قم بإزالة محلول التثبيت واغسل النسيج جيدًا باستخدام PBS ثلاث مرات، ثم قم بتحضير محلول Xal الجاهز للاستخدام عن طريق تخفيف ملليلتر واحد من محلول Xal المخزون بنسبة 1 إلى 40 في محلول التصبيغ الأساسي، وأضف 10 ملليلتر على الأقل منه في الكوب. اغمر الرئة باستخدام قطعة من الشاش. أحكم إغلاق الغطاء بشكل فضفاض للسماح بتبادل الهواء، ثم حضنها عند 37 °C لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس ساعات مع حمايتها من الضوء.

بعد انتهاء فترة الحضن، قم بإزالة محلول xal. اشطف الرئتين مرة واحدة باستخدام PBS لإزالة ما تبقى من محلول xal، ثم أضف 10 ملليلتر على الأقل من 4%paraform aldehyde في PBS. تصبح الأنسجة الآن جاهزة للفحص النسيجي ويمكن تخزينها لفترة طويلة في 4%PFA عند درجة حرارة أربع درجات مئوية.

ابدأ بملء ثلث قالب التضمين بوسط التضمين poly forze غير المخفف. بعد ذلك، ضع فص الرئة في القالب واستمر في إضافة الوسط حتى يتم تغطية الفص بالكامل. تجنب تكوين فقاعات هوائية بعناية، ثم حضّن الفص المضمّن عند درجة حرارة 4 °C لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك، قم بتجهيز الرئات المدمجة للتقطيع عن طريق تجميدها ببطء في خليط من الثلج الجاف والإيزوبنتان. وعند الحاجة، يمكن الآن نقلها إلى مجمد بدرجة حرارة -80 °C للتخزين. باستخدام جهاز التجميد المقطعي (cryostat)، قم بقطع مقاطع تجميدية من الفص بسماكة تتراوح من 7 إلى 10 micron، ثم ثبّت المقاطع على شرائح جاهزة للمقاطع التجميدية متوفرة تجارياً. وبمجرد التثبيت، قم فوراً بتحضين المقاطع في محلول صبغ xal عند درجة حرارة 37 °C لمدة 24 ساعة في غرفة مرطبة. وفي اليوم التالي، اغسل الشرائح بمحلول PBS مرتين لمدة خمس دقائق لكل غسلة.

اتبع ذلك بشطف سريع بالماء المقطر. والآن قم بصبغ الشرائح صبغة تباينية باستخدام صبغة nuclear fast red لمدة 10 ثوانٍ للحصول على صبغة تباينية خفيفة تجعل الـ xal أكثر بروزاً، ثم اشطف الصبغة التباينية فوراً بالماء المقطر. وللحصول على صبغة تباينية أغمق، يمكن تمديد الوقت إلى 30 ثانية أو أكثر.

قم بتثبيت الشرائح باستخدام مثبت مناعي (immuno mount). تمت إعادة استقصاء تكوين النقائل في نماذج OS من الفئران باستخدام خلايا done LM eight. باستخدام الصور التمثيلية الموصوفة هنا للرئات المروية وغير المروية للفئران التي حُقنت في وقت واحد بخلايا done و LM eight المحولة بواسطة laxy والخلايا الضابطة غير المحولة، وفي الفئران التي حُقنت بخلايا done الضابطة.

ظلت النقائل العيانية والمجهرية غير قابلة للكشف في الرئتين غير المروية والمروية. ولكن من المثير للاهتمام أنه في الفئران التي حُقنت بخلايا dun LA Z، كشف صبغ xgl عن بؤر نقيلة مجهرية زرقاء تتكون من خلايا مفردة أو تجمعات خلوية صغيرة على سطح الرئتين غير المروية؛ وقد أدى التروية والتثبيت الموضعي للرئتين إلى تحسين إمكانية الكشف عن النقائل المجهرية لـ dun la z، ومع ذلك، لم يُلاحظ نمو لبؤر عيانية في الفئران التي حُقنت بخلايا LM eight الضابطة. وقد تم التعرف على بؤر نقيلة عيانية شفافة وبالكاد يمكن اكتشافها، يتجاوز قطرها 0.1 millimeter في الرئتين غير المروية. ولم تؤدِ تروية الرئة إلى تحسين الكشف عن هذه البؤر.

ومع ذلك، تم اكتشاف نقائل كبرى متعددة مصبوغة باللون الأزرق باستخدام X gal في الفئران التي حُقنت بخلايا LAC Z على سطح الأعضاء غير المروية. كما تم اكتشاف نقائل صغرى على سطح الأعضاء غير المروية أيضاً. علاوة على ذلك، أدى تروية الرئتين إلى تحسين إمكانية اكتشاف النقائل الكبرى والصغرى بشكل أكبر.

وبناءً على ذلك، أصبحت النقائل الدقيقة والكلية مرئية بكثافة أعلى وبعدد أكبر، ويرجع ذلك أساساً إلى شفافية الأنسجة المروية، حيث أصبحت البؤر الموجودة تحت سطح العضو مرئية أيضاً. وأكد تحليل نسيجي إضافي باستخدام مقاطع تجميدية لأنسجة الرئة تحسن إمكانية اكتشاف نقائل الرئة في الفئران التي حُقنت بخلايا Dun LAX Z المحولة وخلايا LM8، وفي الفئران التي لديها أورام أولية مشتقة من خلايا Dun LAX Z. وقد تم التعرف على النقائل الدقيقة أو حتى بؤر مكونة من خلية واحدة في مقاطع الرئة.

ولم يُلاحظ ذلك في الفئران التي تحمل أوراماً أولية من الخلايا الضابطة المقابلة. علاوة على ذلك، كانت النقائل الكبيرة أكثر وضوحاً في الفئران التي حُقنت بخلايا LM eight LA C مقارنة بالحيوانات التي حُقنت بخلايا LM eight الضابطة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تروية الرئة وتثبيتها في ZI two، ومن ثم إجراء صبغ النقائل في الرئتين المستأصلتين.

تُعد هذه التقنية وسيلة قراءة نهائية عالية الحساسية لتحديد توزيع النقائل في الرئة في أي نوع من دراسات السرطان، كما يمكن أن تعمل كمعيار مرجعي لتحسين تقنيات التصوير الحالية داخل الجسم، مثل micro ct PET و MRI، المستخدمة للكشف المبكر عن الآفات النقيلية.