A التقييم الكمي للهجرة الخليوي من قبل مصلحة دمغ المصوغات المسار على الحركة Phagokinetic

الهدف العام من هذا الإجراء هو التمكن من قياس حركية الخلايا كمياً بمرور الوقت باستخدام مقايسة حركية الخلايا القائمة على جسيمات الذهب النانوية. ويتم تحقيق ذلك من خلال تحضير شرائح غطاء زجاجية أولاً لطلائها بجسيمات الذهب النانوية. وتحديداً، يتم طلاء شرائح غطاء خالية من الداخلي سموم بالجيلاتين ثم تخبيسها بالحرارة.

تتمثل الخطوة الثانية في اختزال حمض chloro oric، وهو ما سيؤدي إلى تكوين جسيمات ذهب نانوية، ومن ثم تغطية الشرائح الزجاجية المغلفة بالجيلاتين بالمحلول بشكل متساوٍ. بعد ذلك، توضع الخلايا على الشرائح الزجاجية المغلفة بجسيمات الذهب النانوية للفترة الزمنية المطلوبة للتجربة. وبالانتقال إلى الخطوة التالية، سيقوم الجيلاتين بإزاحة جسيمات الذهب النانوية مما يؤدي إلى تكوين مسارات.

تتمثل الخطوة النهائية في مراقبة وقياس حركية الخلايا كمياً باستخدام المجهر لتصوير المسارات التي خلفتها الخلايا المتحركة. وفي النهاية، يتم إجراء قياسات لمساحة هذه المسارات باستخدام برنامج متاح مجاناً. وتكمن إحدى المزايا الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل التصوير بنظام الفاصل الزمني، في أن هذا الاختبار لا يتطلب سوى مجهر ضوئي قياسي، وكاميرا قياسية، واستخدام برنامج تصوير متاح مجاناً.

بالإضافة إلى ذلك، يتيح هذا المقايسة بسهولة تحليل ومقارنة عينات متعددة باستخدام منهجية قادرة على إجراء الفحص عالي الإنتاجية. وعلى الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية حول تأثير العوامل الفسيولوجية المختلفة وحركة الخلايا، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى مثل الدراسات المتعلقة بتأثير المسببات المرضية على حركية الخلايا المصابة. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن المنهجية تتطلب الالتزام الصارم بالأحجام ودرجات الحرارة المحددة في البروتوكول.

في هذا البروتوكول، يتم التركيز على تقييم لون المحلول النهائي لجسيمات الذهب النانوية المترسبة لضمان النجاح. ويُعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرًا بالغ الأهمية، نظرًا لصعوبة تعلم خطوات مقايسة حركية مسار FGO.

تتضمن هذه الخطوات عدة إجراءات غير شائعة الاستخدام في مختبرات البيولوجيا الخلوية والجزيئية. لتحضير شرائح التغطية المغلفة بالجيلاتين، قم أولاً بإعادة تعليق الجيلاتين في الماء منزوع الأيونات لتحضير محلول بتركيز نهائي قدره 0.5 grams لكل 300 milliliters، ثم قم بتعقيم الخليط بجهاز التعقيم (autoclave) لمدة تتراوح من 15 إلى 30 minutes. ومن المهم القيام بذلك خلال ساعتين من إضافة الجيلاتين داخل غطاء زراعة الأنسجة (tissue culture hood).

قم بتجهيز شرائح الغطاء للطلاء عن طريق نقل ثماني إلى تسع شرائح غطاء مغسولة بالحمض أولاً إلى طبق بلاستيكي بقطر 100 مليمتر. تأكد من أن شرائح الغطاء لا تلامس بعضها البعض أو جوانب الطبق. قم بنقل قطرتين إلى ثلاث قطرات من الجيلاتين بعناية بواسطة الماصة على كل شريحة غطاء، مع تجنب تدفقها على الطبق.

بعد ذلك، ضع الطبق الذي يحتوي على شرائح الغطاء المغطاة بالجيلاتين في فرن واخبزه عند 90 °C لمدة 10 دقائق. بعد مرور 10 دقائق، أخرج الطبق من الفرن وأعده إلى غطاء زراعة الأنسجة.

اسحب أي كمية زائدة من الجيلاتين برفق باستخدام الماصة. أعد الطبق إلى الفرن وجفف شرائح الغطاء عند 70 °C لمدة 45 دقيقة. بمجرد جفاف شرائح الغطاء، أخرج الطبق من الفرن وأعده إلى غطاء زراعة الأنسجة.

باستخدام إبرة معقمة وبحذر، ارفع أحد جانبي غطاء الشريحة. ثم استخدم ملقطاً معقماً لإزالة أغطية الشرائح المطلية بالجيلاتين من الطبق ووضعها في آبار منفصلة من طبق يحتوي على 24 بئراً. الخطوة التالية هي تحضير أغطية الشرائح المطلية بالذهب الغروي.

ابدأ بتحضير 10 ملي لتر من محلول سترات الصوديوم بتركيز 0.5%، مع العمل داخل غطاء زراعة الأنسجة، وذلك بخلط 1.5 ملي لتر من محلول حمض الكلوريك بتركيز 14.5 ملي مولار، و13.5 ملي لتر من الماء منزوع الأيونات المعقم بجهاز الأوتوكلاف في دورق إرلنماير معقم وخالٍ من السموم الداخلية. بالنسبة لكل ثماني إلى تسع شرائح غطاء، يجب أن تكون النتيجة محلولاً أصفر شاحبًا. حمض الكلوريك مادة سامة ويجب التعامل معها بحذر، كما أنها حساسة للضوء، لذا يجب تنفيذ خطوة الغليان في بيئة ذات إضاءة منخفضة.

عندما يصل المحلول إلى نقطة الغليان، ارفع الدورق من السخان وانقله إلى جهاز التقليب المغناطيسي. ولتكوين جسيمات الذهب الغروية في المحلول، أضف 0.7 milliliters من محلول sodium citrate بتركيز 0.5% لكل 15 milliliters من محلول chloroAURIC acid مع التقليب، واستمر في التقليب لمدة دقيقتين تقريباً. خلال هذه الفترة، سيتغير لون المحلول من الأصفر الباهت إلى الشفاف ثم إلى الرمادي ثم الأرجواني وصولاً إلى الأرجواني الداكن.

قبل الوصول في النهاية إلى لون النبيذ الأحمر أو لون الصدأ ويفضل ذلك، اسحب محلول الذهب الغروي باستخدام ماصة سعة 10 milliliter واترك المحلول ليبرد في الماصة لمدة دقيقة إلى دقيقتين حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة. ثم أضف من 0.5 إلى one milliliter فوق شرائح التغطية المغلفة بالجيلاتين في طبق بـ 24 well. ضع طبق الـ 24 well الذي يحتوي على شرائح التغطية المغطاة بالذهب الغروي في حاضنة عند 37 درجة Celsius واتركها تحضن لمدة 30 دقيقة. بعد أن تأخذ الجسيمات وقتها لتترسب على شرائح التغطية المغلفة بالجيلاتين، افحص كثافتها تحت المجهر الضوئي.

يساعد التوزيع المناسب لجسيمات الذهب النانوية في تمييز حواف شاحنات الطاقة الشمسية بسهولة وكفاءة. وتختلف الكثافة المثلى باختلاف حجم الخلية؛ حيث إن التركيز المرتفع جداً لجسيمات الذهب يعيق قدرة الخلايا على الحركة، بينما يحد التركيز المنخفض جداً من القدرة على تحديد مسار دقيق للحركة.

لهذا السبب، يجب استخدام شرائح التغطية المصنوعة من الدفعة نفسها أو تلك التي تم التحقق من أن لها نفس الكثافة معاً في التجارب الفردية. إذا كان تركيز جزيئات الذهب غير كافٍ، فأضف من 0.5 إلى 1 mL إضافي من محلول الذهب الغروي إلى شرائح التغطية المطلية بالجيلاتين. أما إذا كان تركيز جزيئات الذهب مرتفعاً جداً، كما هو موضح في هذه الحالة، فإن الخيار الفعال الوحيد هو إعادة تحضير محلول الذهب الغروي وطلاء شرائح تغطية جديدة.

إذا كانت كثافة الجسيمات صحيحة، أعد الطبق إلى الحاضنة عند درجة حرارة 37 °C وحضنه لمدة تتراوح بين ساعة واحدة إلى ليلة كاملة، ثم اغسل جسيمات الذهب غير المرتبطة عن طريق غمس الشرائح الغطائية ثلاث مرات في محلول ملحي منظم بالفوسفات معقم. بعد ذلك، احفظ الشرائح الغطائية المطلية بالذهب الغروي في آبار مملوءة بـ PBS في طبق نظيف مكون من 12 بئراً عند درجة حرارة 4 °C حتى يحين موعد استخدامها. يجب عدم ترك الشرائح الغطائية تجف، كما يجب استخدامها خلال شهرين إلى ثلاثة أشهر من تاريخ تحضيرها.

تتمثل الخطوة التالية في تحضير شرائح التغطية المطلية بالذهب الغروي لزراعة الخلايا. ابدأ بوضع هذه الشرائح في آبار منفردة من لوح زراعة يحتوي على 24 بئراً، بحيث يتم إضافة ما يقرب من 0.3 milliliters من وسط الزراعة في كل بئر قبل إضافة شرائح التغطية. انقل ما يتراوح تقريباً بين 5,000 إلى 50,000 خلية إلى كل شريحة تغطية مطلية بالذهب الغروي. سيختلف عدد الخلايا باختلاف نوع الخلية، ولكن يجب أن تكون كثافة الخلايا منخفضة بما يكفي لمنع تداخل مسارات الخلايا الناتجة عن وجود عدة خلايا في المنطقة ذاتها.

قم بتغطية الطبق ووضعه في حاضنة عند 37 °C مع 5% carbon dioxide لمدة تتراوح من 6 إلى 24 ساعة. وبناءً على حركية نوع الخلايا، يجب تحديد الإطار الزمني الأمثل تجريبياً لكل نوع من الخلايا. بعد الحضن، قم بتثبيت أي شرائح غطاء لن يتم تحليلها فوراً عن طريق غمسها مرتين في PBS، يتبع ذلك الحضن في 3% para formaldehyde لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. باستخدام المجهر، التقط صوراً للمسارات التي خلفتها خلية واحدة متحركة على شرائح الغطاء غير المثبتة أو المثبتة. يختلف التكبير المستخدم لالتقاط صور المسارات الخلوية اعتماداً على نوع الخلية، ومع ذلك، يجب استخدام نفس التكبير في كل دراسة من أجل التمكن من مقارنة النتائج.

بالنسبة للخلايا الوحيدة، فإن التكبير بمقدار 40x يعمل بشكل جيد باستخدام البرامج المتاحة مجانًا مثل image أو JNIH image أو image tool؛ قم بتحديد متوسط المساحة التي خلت من الذهب الغروي بواسطة 10 إلى 20 خلية أو أكثر لكل عينة من الصور الملتقطة. يظهر هنا المسار الخالي من جزيئات الذهب الغروي بواسطة خلية وحيدة واحدة غير محفزة، تم تصويرها باستخدام عدسة شيئية بقوة 40x. تخلق الخلايا غير المتحركة مسارات مميزة صغيرة بيضاوية أو دائرية الشكل حول نفسها، مما يشير إلى مستوى منخفض من الحركة الأساسية. وفي المقابل، تتميز الخلايا عالية الحركة بحركة توجيهية تظهر في شكل مسارات مستطيلة ومساحات كلية أكبر نظرًا لأشكالها غير المنتظمة.

يُفضل تحليل مسارات الخلايا باستخدام أداة الرسم الحر (freehand tool) في برنامج Image J لتحديد حجمها. ويمكن بعد ذلك إجراء قياسات كمية للمساحة باستخدام أداة القياس (measure tool) الموجودة في قائمة التحليل في برنامج Image J. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الالتزام الصارم بالأحجام ودرجات الحرارة الموضحة في البروتوكول، حيث إن أي انحرافات قد تؤثر بقوة على النتائج النهائية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء شرائح غطاء مغطاة بالجيلاتين، وكيفية تحضير جسيمات الذهب النانوية وشرائح الغطاء المغطاة بجسيمات الذهب النانوية، وكيفية مراقبة وتقييم حركة الخلايا كمياً باستخدام المجهر الضوئي.

تذكر أن العمل مع المحاليل المغلية على لوح تسخين، وخاصة الأبخرة المتصاعدة من المحلول المغلي لحمض fluoro وAIC وسترات الصوديوم، يمكن أن يكون خطيرًا؛ لذا يجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل العمل داخل خزانة استخلاص الغازات (الشفاط) وتوخي الحذر والمنطق السليم أثناء تنفيذ هذا الإجراء.