على رقاقة Phenotyping التهاب غشائي

الهدف من هذا الفيديو هو توضيح تقنية "المختبر على رقاقة" (lab on a chip) لتوصيف الحالة الالتهابية للخلايا البطانية. في البداية، يتم إنماء الخلايا البطانية للأبهر البشري حتى تصل إلى مرحلة الالتحام على ركيزة زراعة الأنسجة، ثم تُوضع في جهاز قص Conan plate. تُعالج الخلايا بالسيتوكين المحفز للالتهاب، TNF alpha، وفي الوقت ذاته تُعرض لظروف إجهاد قص متفاوتة لمدة أربع ساعات من خلال التحكم الدقيق في دوران المخروط الموجود فوق الركيزة؛ حيث يقوم إجهاد القص بتعديل الاستجابة الالتهابية المعروفة للسيتوكين.

ويشمل ذلك زيادة تنظيم جزيئات الالتصاق مثل VCA one وICAM one. تُنقل الركيزة إلى منصة المجهر حيث يتم إغلاق جهاز A-P-D-M-S للموائع الدقيقة بإحكام باستخدام التفريغ مباشرة على الطبقة الأحادية لإنشاء قنوات التدفق. يتم تمرير خلايا THP one الوحيدية المنشطة فوق الخلايا البطانية الجيبية (hs) المهيأة مسبقاً، حيث ترتبط هذه الخلايا بما يتناسب مع مستوى تعبير جزيئات الالتصاق الخلوي.

يتم تحديد الحالة الالتهابية للبطانة الغشائية عن طريق قياس العدد الإجمالي لخلايا THP-1 التي تم تثبيتها بإحكام. مرحباً، اسمي شيدي ديفيرس، وأنا غريغ فوستر، وأنا كيث بيلي.

نحن الآن في مختبرات الأستاذين باستور وسايمون في قسم الهندسة الطبية الحيوية بجامعة كاليفورنيا في ديفيس. سنقوم اليوم بشرح استخدام نهج يعتمد على "مختبر على شريحة" لفحص الخلل الوظيفي الالتهابي والبطاني كمياً. توفر هذه الأدوات منصة تتيح لنا إجراء دراسات تتعلق بتراكب الإجهاد الأيضي مع العوامل الهيدروديناميكية، وتنظيم النمط الظاهري الالتهابي للبطانة ومدى قابليتها للإصابة بتصلب الشرايين.

لذا فإننا نشير إلى أجهزتنا باسم الغرف الموائعية الدقيقة المحاكية للأوعية الدموية، أو vmmc. تتيح لنا هذه الأجهزة قياس النتائج الالتهابية في الخلايا البطانية والخلايا الوحيدة تحت ظروف تحاكي تلك الموجودة في الأوعية المسببة لتصلب الشرايين. كما تسهل vmmc استخدام كميات صغيرة من الكواشف أو المواد التي قد تكون متوفرة بكميات محدودة.

ويمكن أيضاً تصنيعها بتخطيطات وهندسات متعددة قابلة للتخصيص، مما يجعلها مناسبة جداً لمجموعة واسعة من التطبيقات. وسنقوم اليوم باستعراض تجربة نموذجية باستخدام نهج المختبر على شريحة الخاص بنا، حيث سيتم تعريض طبقات أحادية من الخلايا البطانية البشرية لتنشيط السيتوكين تحت تأثير إجهادات قص محددة بدقة.

سنقوم بتوضيح استخدام VMC لقياس كمية تجنيد الخلايا الوحيدة البشرية إلى الطبقة أحادية الخلية في الوقت الفعلي كمؤشر وظيفي لتنشيط البطانة الغشائية باستخدام المخرطة؛ حيث يتم خرط ركائز دائرية بحجم ثلاث بوصات من أطباق زراعة الأنسجة قطرها 100 مليمتر. تُغسل الركائز ذات الثلاث بوصات بالماء المقطر، ثم تُعقم عن طريق الغمر في 70%ethanol. تُوضع الركائز المعقمة في أطباق بتري قطرها 100 مليمتر وتُترك لتجف.

يتم بعد ذلك تحضينها مع كولاجين من النوع الأول بتركيز 100 µg/mL لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ثم تُغسل باستخدام PBS. يتم تعليق الخلايا البطانية للشريان الأورطي البشري (HA) بتركيز 650,000 خلية/mL. توضع كمية 1 mL من معلق الخلايا على شكل قطرات فوق ركيزة مجففة ومطلية بالكولاجين، ثم تُوزع لتشكل معلقاً متساوياً.

توضع الركائز المزروعة بعد ذلك في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C و5% CO2 للسماح للخلايا بالالتصاق بسطح الركيزة. وبعد مرور ساعة واحدة، يتم إضافة 9 mL من وسط النمو E GM two، وتُترك الخلايا لتنمو في طبقات أحادية حتى تصل نسبة التلاقي إلى 90% تقريبًا، وعندها تصبح الطبقات الأحادية جاهزة للاستخدام في تجارب القص اللاحقة. يتم بناء غرف الموائع الدقيقة المحاكية للأوعية الدموية عن طريق صب PDMS فوق قالب رئيسي يتكون من هندسة القناة المطلوبة.

يُصبّ قاعدة السيليكون في قالب بلاستيكي، يليه عامل تصلد السيليكون بنسبة 10 إلى 1 من حيث الوزن. ثم يُخلط هلام PDMS جيداً، مع الحرص على عدم كشط جوانب القالب، وذلك لتجنب إدخال رقاقات بلاستيكية في الخليط. وتُنظف قوالب الماستر المقاومة للضوء باستخدام الهكسان وتُجهز لصب VMMC.

يُصب خليط PDMS بعد ذلك فوق القالب الرئيسي، ثم يُوضع في غرفة تفريغ. في الغرفة، يتم إزالة الهواء من خليط PDMS حيث يصعد إلى السطح بعد 15 دقيقة.

يتم إزالة القالب من الغرفة، وينفخ الهواء برفق فوق سطح PDMS لتفريغ فقاعات الهواء المتبقية من القالب. ثم يُغطى القالب ويوضع في فرن عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة حتى يتمما معالجة PDMS. أخرج هلام PDMS المتصلب من الفرن وقم بعمل شقوق دائرية حول الغرفة باستخدام مشرط صغير.

من الضروري القيام بذلك تدريجياً لتجنب ملامسة مادة المقاوم الضوئي (photo resist)، حيث سيؤدي ذلك إلى إتلاف القالب الرئيسي. استأصل غرفة الموائع الدقيقة من منافذ الدخول والخروج في ثقابة القالب لكل قناة باستخدام إبرة Luer Lock قياس 19. بالإضافة إلى ذلك، قم بثقب فتحات لأنابيب التفريغ بعيداً عن القنوات.

لقد اكتمل الآن التحضير لـ VMMC. قم بنقل السيتوكين المسبب للالتهابات TNF alpha باستخدام الماصة إلى ستة مليليترات من وسط L 15 للوصول إلى تركيز نهائي قدره 0.5 nanograms per milliliter. يتم استخدام وسط L 15 هنا كسائل قص نظراً لقدرته على تنظيم pH في غياب 5%CO2.

يتم بعد ذلك سحب الوسط إلى حقنة معقمة سعة 10 milliliter، والتي تُستخدم لتعبئة جهاز القص. ثم تُنقل الطبقة الأحادية المتلاحمة إلى جهاز قص الخلايا، الذي تم تعقيمه بالإيثانول وموازنته، مع ضبط ارتفاع فجوة المخروط. تُزال الركيزة من طبق بتري وتوضع على كتلة القياس الزجاجية، ثم تُدخل بعناية في مركز الجزء السفلي من غرفة الغلاف، بحيث يكون المخروط فوق الخلايا مباشرةً.

يتم تثبيت الركيزة عن طريق شد براغي الفولاذ المقاوم للصدأ بالتساوي حول كتلة القياس. ثم يتم تحميل وسط القص في الغرفة، مع الحرص على عدم إدخال أي فقاعات هوائية. بعد ذلك، يُستخدم جهاز كمبيوتر لإدخال برنامج إجهاد القص المطلوب، ثم يتم تشغيل المحرك الدقيق المنفصل.

نستخدم هنا قصاً تذبذبياً بقيمة صفر زائد أو ناقص 5 dines per centimeter squared. وبعد مرور أربع ساعات، يتم إيقاف برنامج القص. ثم تُزال كتلة القياس، ويوضع الركيزة بعناية مرة أخرى في طبق بتري.

أصبحت الخلايا الآن جاهزة لاختبار التصاق الخلايا الوحيدة. مباشرة بعد عملية القص، تُنقل الطبقات أحادية الخلية من حمض الهيالورونيك (HA) إلى محطة المجهر لتجميع غرفة الميكروفلويديك ذات القيمة المتغيرة (VMMC). يتم توصيل الـ VMMC بخرطوم التفريغ وغمرها في مياه منزوعة الأيونات (DI water) لإزالة أي فقاعات هواء محتبسة داخل القنوات.

مع إغلاق صمام التفريغ في البداية، يتم ضغط الغرفة بعناية فوق الطبقة أحادية الخلية ثم يتم فتح صمام التفريغ. ومن الضروري هنا التأكد من عدم وجود فقاعات هواء محبوسة داخل قنوات الغرفة. الآن، يتم سحب 80 µL من HBSS المحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم باستخدام ماصة ووضعها في خزان مصنوع من قطع طرف إبرة lure Lock مقاس 19 Gauge، ثم يُدفع السائل خارج الطرف عن طريق الضغط بقوة على الجزء العلوي من الخزان، الذي يتم إدخاله بعد ذلك في منفذ الإدخال الخاص بـ VMMC.

توضع المجموعة كاملة على منصة المجهر، ثم يتم تشغيل كاميرا المجهر وشاشة عرض الفيديو. يتم تحميل حقنة زجاجية سعة 10 milliliter على مضخة الحقن. بعد ذلك، يتم توصيل أنابيب الحقنة بفتحة المخرج في VMMC.

يتم ضبط معدل التدفق لإحداث إجهاد قص مقداره 1 dyn/cm² داخل القناة، ثم يتم التشغيل في وضع إعادة الملء بحيث تسحب السرنجة السائل من الخزان عبر القناة. يتم تعليق خلايا Th P one المحفزة بـ SDF one بتركيز 2 million cells/mL. وفي غضون دقيقتين من تفعيل التدفق، يتم إضافة 50 µL من معلق الخلايا إلى الخزان.

ومرة أخرى، يجب توخي الحذر لتجنب إدخال فقاعات هوائية عند وصول التدفق إلى مرحلة التطوير الكامل. يتم التقاط الفيديو بمعدل ثلاثة إطارات في الثانية ويتم تعداد البيانات باستخدام برنامج Image J. تُعرَّف خلايا THP one الملتصقة بأنها الخلايا التي لا تتحرك أكثر من نصف قطر الخلية الواحد في غضون 10 ثوانٍ.

نعرض هنا بيانات توضح التصاق خلايا THP-1 بطبقات أحادية من الخلايا البطانية المحفزة بـ TNF alpha والمجهزة إما تحت إجهاد قص جداري مرتفع وثابت قدره 15 dynes/cm² أو إجهاد قص تذبذبي قدره 0 ± 5 dynes/cm². وأظهرت الطبقات الأحادية المجهزة بإجهاد قص تذبذبي زيادة في تجنيد خلايا THP-1 بمقدار ثلاثة أضعاف مقارنة بالطبقات التي تعرضت لإجهاد قص مرتفع. ونوضح اليوم استخدام تقنيات مخبرية قابلة للتخصيص يمكن دمجها لتوفير رؤى هامة حول الأحداث الالتهابية المبكرة التي تكمن وراء تصلب الشرايين. وتحديداً، نقوم بقياس النتائج المرتبطة بالخلل الوظيفي البطاني والخلايا المعرضة للمحفزات الالتهابية تحت ظروف هيدروديناميكية محددة بدقة.

يتيح لنا استخدام VMM CS فحص آليات محددة تكمن وراء تفاعلات التصاق الخلايا البطانية وكريات الدم البيضاء. كما تتميز هذه الأجهزة بكونها مرنة وغير مكلفة، وتسهل استخدام المواد التي قد تكون محدودة التوفر، مثل المكونات المشتقة من المصل من البشر. وقد شملت دراساتنا التي طبقت هذه الأجهزة أبحاثاً حول الالتهابات التي تحفزها السيتوكينات والدهون ومستقبلات RAGE في الخلايا البطانية.

لقد طورنا أيضاً مقايسات على الشريحة لفحص آليات الالتصاق في أنواع متعددة من الكريات البيضاء وكذلك في الدم الكامل. وفي نهاية المطاف، نتصور أن هذه التقنية ستؤدي إلى تطوير مناهج خارج الجسم لتقييم مخاطر إصابة الفرد بأمراض القلب والأوعية الدموية التي يتوسطها الالتهاب.