باستخدام الماوس BLT إنساني وساق الموديل خلية مقرها جين ورم العلاج

الهدف العام من التجربة التالية هو إنتاج فئران تحمل جهازاً مناعياً بشرياً معدلاً. ويتم تحقيق ذلك من خلال تحضير الفأر أولاً للجراحة، ثم وضع قطعة من الغدة الزعترية في المِبزل في الخطوة الثانية. يتم خلط Matrigel مع خلايا منقولة سالبة لـ CD 34 وموجبة لـ CD 34، ثم تضاف هذه المزيج إلى المِبزل.

بعد ذلك، تُزرع بنيات الماتريجيل (matrigel) تحت محفظة الكلى. وفي نهاية المطاف، يمكن مراقبة رفض الأورام المستهدفة بواسطة خلايا CD8 T المعدلة وراثياً من خلال التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) الحي والقياسات الفيزيائية للأورام. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل النماذج العصبية الكاملة في أن هذه الطريقة تسمح بدراسة تطور الخلايا الجذعية البشرية المعدلة وراثياً داخل الغدة الزعترية البشرية، وما يلي ذلك من اختبار الفعالية في الجسم الحي للسلالات المشتقة؛ وسيقوم بتنفيذ هذا الإجراء ثلاثة فنيين من مختبراتنا، وهم غريغوري بريستول، وبيرنارد ليفين، وشون كيم.

في هذا المخطط التوضيحي، يتم عرض نموذج BLT المعدل المستخدم في هذه الدراسات لإنتاج فئران خيمرية تحمل خلايا T محددة من نوع mart. يتم بناء الطعم من خلايا CD 34 محولة وغير محولة تم عزلها من كبد جنيني ذاتي. بعد ذلك، يتم تجميد جزء من الخلايا المحولة وحقنه في الفئران التي تعرضت للإشعاع بعد مرور أربعة إلى ستة أسابيع.

يتم في هذا الفيديو توضيح عملية زرع البنية الحية، وذلك بمجرد أن تصبح الحيوانات خاملة نتيجة التخدير. ابدأ بحلاقة الجانب الأيسر لكل فأر من الورك إلى الكتف، في المنطقة الواقعة بين منتصف الظهر والبطن. وبعد تسجيل وزن كل حيوان، قم بثقب آذانها لترقيمها، ثم احقن 0.3 milliliters من دواء carprofen تحت الجلد في كتف كل منها.

بعد ذلك، ضع الفئران على جوانبها اليمنى بحيث تكون مواجهة لليسار. الآن، قم بغسل مِبزل إبرة زراعة السرطان من عيار 16 ذات طرف مبرد دائري باستخدام PBS. وباستخدام ملقط مدبب، أضف قطعة من الغدة الزعترية إلى طبق PBS، ثم أمسك المِبزل بشكل أفقي مع القضيب.

قم بشفط النسيج من داخل الطرف مباشرة. يُعد تمرير المسبار (trocar) أسفل كبسولة الكلية وحقن النسيج أحد أصعب جوانب هذا الإجراء. بعد ذلك، استعن بمساعد.

استخدم ماصة إزاحة إيجابية الطرف (end orph positive displacement pipette) لمزج خمسة ميكرولتر (5 µL) من الماتريجيل (matrigel) البارد في أنبوب واحد من الخلايا مع التقليب برفق. مع الحفاظ على وضعية المِرسال (trocar) بشكل أفقي، اسحب القضيب ببطء بينما يقوم المساعد بسحب الماتريجيل بواسطة الماصة.

امزج المكونات في المِبزل لكل فأر. أولاً، امسح الجلد المكشوف للحيوان بمحلول Betadine ثم نظفه بمسحة من الإيزوبروبانول. حدد مرتين النقطة الأكثر دكنة تحت الجلد، والتي تشير إلى موقع الطحال.

توجد الكلية على بُعد حوالي 5 mm ظهرياً من الطحال، وذلك باستخدام ملاقط غير حادة لرفع الجلد الذي يغطي الكلية. يتم إجراء شق بطول 15 mm تقريباً في الجلد بشكل موازٍ للطحال، ثم يتم إجراء شق مماثل في طبقة العضلة البريتونية الموجودة أدناه.

يجب أن تكون الكلية مرئية بشكل مباشر في الذكور؛ لذا يكفي الضغط على البطن لإخراجها. أما في الإناث، فمع الاستمرار في الضغط على البطن باليد اليسرى لإبقاء الكلية مكشوفة، استخدم أولاً ملقطاً جراحياً (hemostat) للإمساك بالمبيض، ثم اسحب الكلية للخارج للمساعدة في تثبيت العضو خارج الجسم.

أحدث ثقباً صغيراً في الطرف الخلفي لمحفظة الكلية، ثم قم بتمرير المِبزل داخل هذا الثقب وعلى طول الكلية حتى يتم تغطية فتحة المِبزل بالكامل بواسطة محفظة الكلية. بعد ذلك، وباستخدام الخنصر من اليد اليمنى، قم بحقن النسيج. الآن، استخدم الملقط الدموي المغلق لدفع الكلية برفق وإعادتها إلى مكانها.

قم بعمل غرزة واحدة في الصفاق بربطة مزدوجة، مع تضييق الجلد ككيس صغير، ثم ثبتها بمشبكين للجروح. وأخيرًا، ضع قطرة من PBS على كل عين وضع الفأر على جانبه في القفص فوق بعض الفرش. وبعد زراعة جميع الفئران بنفس الطريقة، تأكد من عودة الحيوانات إلى وضعية الاستلقاء على بطونها قبل تركها.

يوضح هذا الشكل الأول صورة تمثيلية لزرع THI الحي في الفئران ذات الجهاز المناعي البشري. ويُظهر هذا الشكل التطور الطبيعي للأنسجة الزعترية والتوزيع النسيجي الفسيولوجي لخلايا T البشرية الموجبة لـ CD4 وCD8. وبعد عملية إعادة التكوين، تحمل الحيوانات جهازاً مناعياً بشرياً بتوزيع طبيعي لخلايا T الموجبة لـ CD4 وCD8.

تظهر هنا صورة تمثيلية لفأر يحمل ورماً ميلانومياً. تشير المناطق الرمادية إلى صورة التصوير المقطعي المحوسب (CT scan)، بينما تشير المناطق الملونة إلى النشاط الأيضي للورم كما تم رصده بواسطة التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET scan).

أشار الفحص بالأشعة المقطعية (CT scan) وحده في هذه التجربة إلى وجود كتلة ورمية كبيرة في المنطقة المحددة بالدائرة البيضاء. ومع ذلك، وكما يوضح تصوير PET الحي (in vivo)، فإن هذه المنطقة تتكون في الغالب من أنسجة نخرية وأنسجة ندبية، مما يؤكد فائدة تصوير PET كوسيلة أكثر حساسية ودقة لتقييم تراجع الورم وتطهيره. وبعد هذا الإجراء، يمكن إجراء فحوصات أخرى مثل تحليل الخلايا التائية (T-cell)، والتنميط الظاهري (phenotyping)، والتنشيط خارج الجسم (ex vivo activation) للإجابة على الأسئلة المتعلقة بوظيفة الخلايا التائية.