إصلاح نموذج الحرجة الحجم عيب قبي طريق الدهنية المشتقة من الخلايا اللحمية المقطوع Lipoaspirate

الهدف العام من هذا الإجراء هو حصاد الخلايا السدوية متعددة القدرات من النسيج الدهني لغرض التمايز العظمي، باستخدام نموذج فيزيولوجي لخلل في عظم الجمجمة في الفأر. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل الخلايا السلفية من الطبقة السدوية الوعائية للنسيج الدهني، والتي يمكن الحصول عليها بعد عملية شفط الدهون. وتتمثل الخطوة التالية في تحضير هيكل ثلاثي الأبعاد ثم استزراع الخلايا على تلك السقالة.

تتمثل الخطوة النهائية في إحداث عيب في الجمجمة بحجم حرج في نموذج من الجرذان، حيث يتم وضع السقالات والخلايا بداخله. وفي النهاية، تظهر النتائج أن الخلايا السدوية متعددة القدرات المعزولة من الأنسجة الدهنية تمتلك القدرة على تجديد الهيكل العظمي داخل الجسم. وتتمتع تطبيقات هذه التقنية بنطاق واسع من الاستخدامات السريرية الممكنة نظراً للنقص في الأنسجة المتاحة لتجديد الهيكل العظمي.

بينما تُعد الطعوم العظمية الذاتية المعيار الذهبي، فإن نقص مواقع التبرع والمراضة المرتبطة بموقع التبرع يحدان من هذا الخيار. ويمكن استخدام الطعوم الخيفية والمواد الغريبة، ولكنها تظل محدودة بسبب التكلفة، وضعف التكامل، واحتمالية حدوث عدوى.

إن الاستخدام المحتمل للأنسجة الدهنية لعزل الخلايا السلفية المخصصة لهندسة الأنسجة الهيكلية هو أمر مثير للاهتمام. سأقوم أنا ومايكل تشانج من مختبر لونج أنكور بتوضيح هذا الإجراء. أولاً، يتم الحصول على الأنسجة الدهنية تحت الجلد البشرية من إجراءات شفط الدهون الاختيارية.

ولاحظ وجود طبقتين في المادة المشفوطة من الدهون. تحتوي الطبقة العلوية على الغالبية العظمى من المادة الخلوية المعالجة، بينما تتكون الطبقة السفلية في الغالب من المحلول الملحي المحقون.

يمكن حصاد الخلايا السدوية المشتقة من الأنسجة الدهنية من أي من الطبقتين، إلا أن العائد يكون أكبر بكثير من الطافي. لعزل الجزء الوعائي السدوي أو SVF، اغسل المادة المشفوطة من الدهون بشكل مكثف بأحجام متساوية من محلول ملحي منظم بالفوسفات بتركيز 1x أو PBS يحتوي على 2.5% Betadine، ثم اشفط حجماً مساوياً من 1x PBS بدون Betadine. اترك ناتج الغسيل ليترسب.

تأكد من الحفاظ على التقنية المعقمة طوال العملية لتجنب التلوث بالأنسجة البشرية المعالجة. بعد ذلك، قم بشفط الطبقة السفلية والتخلص منها بعد كل عملية غسيل، ثم انقل 15 milliliters من الأنسجة الدهنية إلى أنابيب Falcon المخروطية سعة 50 milliliter. ثم قم بهضم الأنسجة الدهنية في 15 milliliter من محلول 0.075% المفلتر.

أضف الكولاجيناز من النوع الثاني في محلول هانك الملح المتوازن أو HBSS عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 60 دقيقة مع التقليب المستمر، مع الحرص على تهوية الأنابيب كل 15 دقيقة. بعد ذلك، قم بتعادل نشاط الإنزيم بإضافة 15 ملليلتر من محلول PBS المحتوي على 10% مصل جنين البقر أو FBS ثم قم بالطرد المركزي. وللحصول على كريّة عالية الكثافة من الجزء الوعائي الجزئي SVF، ستكون الكريّة عبارة عن مزيج من الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية وكريات الدم الحمراء.

تخلص من طبقة الدهون الطافية أولاً، ثم تخلص من الطبقة السائلة الطافية دون تحريك الراسب. أعد تعليق الراسب في 10 milliliters من وسط النمو التقليدي. بعد ذلك، اجمع محتويات الأنابيب الثلاثة في أنبوب مخروطي نظيف سعة 50 milliliter عبر مرشح بمسامية 100 micron ثم قم بإجراء عملية الطرد المركزي.

تخلص من السائل الطافي دون تحريك الراسب، ثم أعد تعليق الراسب. في خمسة مليلتر من وسط نمو تقليدي، ادمج أنبوبين مخروطيين سعة 50 مليلتر لكل طبق قطر 10 سنتيمتر، أو خمسة أنابيب مخروطيين سعة 5 مليلتر لطبق قطر 15 سنتيمتر. قم بتأسيس المزارع الأولية طوال الليل عند 37 °C مع 21% oxygen و 5% carbon dioxide.

بعد التحضين طوال الليل، اغسل الأطباق بمحلول PBS لإزالة خلايا الدم الحمراء المتبقية غير الملتصقة. المجموعات الخلوية الناتجة هي خلايا سدومية مشتقة من الأنسجة الدهنية. حافظ على الخلايا عند مستويات دون تلاقي (sub confluent) لمنع التمايز التلقائي.

عند درجة حرارة 37 °C، و21% oxygen، و5% carbon dioxide. وفي أوساط النمو، تحتاج الخلايا عموماً إلى التقسيم كل ثلاثة إلى أربعة أيام في أوساط نمو منتظمة. وعندما تصل الخلايا إلى 50% confluence في الطبق، يتم تحضير السقالة كما هو موضح في المخطوطة المرفقة.

عندما تصل الخلايا إلى مستويات ما دون الالتحام، اغسل الخلايا بمحلول PBS مرتين ثم استخدم التريبسين. قم بعد الخلايا لتقدير كميتها. ومن أجل الاستزراع، استعد لاستزراع الخلايا على سحالات مقصوصة مسبقاً بقطر 4 مم بكثافة 1.5 × 10⁵ خلية.

ضع سِقالة واحدة في بئر واحد من طبق مكون من 96 بئراً، ثم أعد تعليق الخلايا في وسط نمو عادي بتركيز يبلغ حوالي 1.5 × 10⁵ خلية لكل 20 µL من الوسط. قم باستزراع السِقالة عن طريق نقل 20 µL من المحلول مباشرة إلى السِقالة، ثم ضعها في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 30 دقيقة.

بعد مرور 30 دقيقة، أضف 200 µL من الوسط الغذائي واترك الخلايا لتحضن على السقالة طوال الليل. قبل الجراحة، ليس من الضروري التأكد من التصاق الخلايا بالسقالة كما هو الحال عند الاستزراع؛ حيث ستضمن الأعداد الكافية من الخلايا التصاق غالبيتها بالسقالة.

بعد تخدير فأر بالغ من نوع CD one nude يبلغ من العمر 60 يوماً، يتم تعقيم موقع الجراحة باستخدام Betadine والكحول ثلاث مرات، ووضع مادة مزلقة على عيني الفأر. بعد ذلك، يتم إجراء شق سهمي في خط الوسط في فروة رأس الفأر للكشف عن العظم الجداري الأيمن. ثم يتم إزالة السمحاق من العظم الجداري الأيمن عن طريق الكشط غير الحاد.

بعد ذلك، قم بعمل ثقب أحادي الجانب بسُمك كامل وبقطر 4 ملم في العظم الجداري الأيمن بعيداً عن مناطق الالتحام العظمي. وباستخدام ريشة مثقاب ذات أسنان مطلية بالألماس، يجب توخي الحذر الشديد لتجنب إصابة الأم الجافية الكامنة أسفل العظم، حيث أن سُمك جمجمة الفأر يقل عن 0.3 ملم قبل الزرع. اغسل السقالات بمحلول PBS معقم لمنع انتقال عوامل النمو المشتقة من الوسط الزراعي.

ضع السقالة في موضع العيب. وأخيراً، قم بخياطة الجلد وإغلاقه ومراقبة الحيوان وفقاً لبروتوكولات ما بعد الجراحة المعتمدة. أجرِ تصويراً مقطعياً ميكروياً (micro CT) للفأر واحصل على صورة معاد بناؤها ثلاثية الأبعاد باستخدام برنامج microview.

استخدم برنامج Adobe Photoshop لضبط الصور إلى ارتفاع قياسي. عادةً ما نقوم بالقياس لتقييم تجدد القحف كل أسبوعين. يتم تخدير الفئران أثناء الفحص للمتابعة طويلة المدى، وفي النهاية يتم القتل الرحيم لها.

لإجراء التحليل النسيجي، استخدم ميزة "العصا السحرية" (magic wand) لقياس بكسلات العيب في القحف. حدد نسبة التئام العيب من خلال صور الأشعة المقطعية (CT) اللاحقة. يتم قياس مساحة العيب القحفي وتحديد عدد البكسلات وقسمته على عدد بكسلات العيب الأصلي، ثم صبغ مقاطع متعددة على طول امتداد العيب باستخدام صبغات نسيجية مثل aniline blue و picro sirius red للدلالة على تكوين العظم.

استخدم برنامج adobe Photoshop لقص جميع المناطق التي لا تقع ضمن عيب القحف، واستخدم أداة العصا السحرية (magic wand) لتحديد عدد البكسلات لتكون العظم الجديد في منطقة العيب، ثم قارن ذلك بالمجموعات الضابطة أو المتغيرات الأخرى الموضحة. إليك نظرة عامة على عمليات جمع وتطبيق شفاط الدهون، بدءاً من عزل الخلايا السدوية المشتقة من الأنسجة الدهنية وصولاً إلى تنميتها وتمايزها واستخدامها في المختبر (in vitro) وفي الجسم الحي (in vivo). يظهر هنا تصوير ميكرو توموجرافي (micro CT) يوضح التئام عيب القحف ذو الحجم الحرج في الجسم الحي بعد تطبيق الخلايا الجذعية السدوية (ASCs) عبر ساند من الهيدروكسيباتيت، كما هو موضح في الصف السفلي.

تشمل الضوابط، التي تظهر في الصف العلوي، عدم وجود سِقالة ووجود خلل. ويظهر الصف الأوسط الخلل مع وضع السِّقالة بدون خلايا. يمثل LS الموضح هنا قياساً كمياً للالتئام العظمي باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro ct)، والذي يظهر زيادة معنوية في الالتئام في مجموعة A SC.

هذه صورة نسيجية تظهر زيادة في تكوين العظام في مجموعة A SC عبر andal. وباللون الأزرق، يصبغ AROM من أجل al. وباللون الأزرق، يظهر النسيج العظمي (osteoid) مصبوغاً باللون الأزرق الداكن من أجل pen arom.

تظهر صبغات العظم الوليدي الصفراء الموضحة هنا خلايا جذعية ميزنكيمية بشرية (ASCs) مُعلمة ببروتين GFP، والتي تم استزراعها على سِقالة وتم التضحية بالحيوان بعد أسبوعين. وقد أُجري التصبيغ باستخدام جسم مضاد مُعلم بـ GFP لإظهار مساهمة الخلايا البشرية في التجديد في منطقة العيب. كما يظهر هنا الكيمياء النسيجية المناعية للمستضد النووي البشري، والتي توضح انتشار الخلايا البشرية في منطقة العيب بعد أسبوعين.

بمجرد إتقان العملية، يمكن معالجة النسيج الدهني في غضون أربع ساعات، وقد تستغرق العملية الجراحية حوالي 10 دقائق لكل فأر. من المهم تذكر أن العظم الجداري مستدير بينما المثقاب مسطح، لذا يجب توخي الحذر لاختراق كامل محيط العيب الذي يبلغ قطره أربعة مليمترات. تذكر التحرك ببطء لتجنب إصابة الأم الجافية في الدماغ.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية عزل الخلايا السلفية من النسيج الدهني، وكيفية استزراع هذه الخلايا على ساند ثم زرعها في الفأر.