الكم النقاط المدمجة لواحدة جزيء التصوير

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير نقاط كمومية فلورية ذات سطوع واستقرار مُحسَّنين، مع تقليل الحجم والارتباط غير النوعي لاستخدامها في تصوير الجزيء الواحد. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير نوى نقاط كمومية صغيرة من سيلينيد الكادميوم. وتتمثل الخطوة الثانية في سبك هذه النوى مع الزئبق لإزاحة فلوريتها نحو الطيف الأحمر وزيادة سطوعها.

بعد ذلك، يتم تنمية غلاف سبائكي رقيق على البلورات النانوية لتثبيت انبعاث الفلورة الخاص بها. وتتمثل الخطوة النهائية في نقل هذه الجسيمات من المذيبات العضوية إلى المحاليل المنظمة المائية باستخدام بوليمر متعدد السنون، والذي يمكن تعديله باستخدام البولي إيثيلين جليكول الخامل بيولوجياً. وفي النهاية، يُستخدم قياس الطيف الفلوري، والكروماتوغرافيا الهلامية، والترحيل الكهربائي الهلامي لإثبات أن هذه الجسيمات تتمتع بفلورة ساطعة، وحجم هيدروديناميكي مدمج، وشحنة إلكتروستاتيكية متعادلة؛ وهي خصائص مناسبة تماماً للتصوير الفلوري للجزيء الواحد في علم الأحياء.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه النقاط الكمومية مقارنة بالمواد التجارية المتاحة في أن هذه الجسيمات النانوية تمتلك حجماً هيدروديناميكياً أقل بكثير. وعلى الرغم من أن النقاط الكمومية الأصغر حجماً تتأثر سلباً بانخفاض شدة الفلورة، وتراجع استقرار الفلورة، واقتصار الفلورة على الطيف الأزرق فقط، فقد تمكنا من تعويض هذه الآثار باستخدام عملية تبادل كاتيونات الزئبق. ويمكن لهذه البلورات النانوية أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في الفيزياء الحيوية والإشارات الخلوية من خلال تمكين التصوير الديناميكي للجزيئات الحيوية المفردة في البيئات البيولوجية المزدحمة.

للبدء، قم بتحضير محلول من السيلينيوم بتركيز 0.4 molar في top عن طريق إضافة السيلينيوم إلى دورق ثلاثي العنق سعة 50 milliliter، ثم قم بتفريغ الدورق تحت فراغ عالٍ وملئه بغاز الأرجون باستخدام خط sch shank في ظروف خالية من الهواء. أضف 10 milliliters من top وسخن المزيج إلى 100 degrees Celsius مع التقليب لمدة ساعة واحدة للحصول على محلول رائق عديم اللون.

برد المحلول حتى درجة حرارة الغرفة واترك الدورق جانباً. قم أيضاً بتحضير محلول من أكسيد الكادميوم وTDPA وODE في دورق ثلاثي العنق سعة 250 milliliter باستخدام الكميات المدرجة في البروتوكول المكتوب المرفق بهذا الفيديو، ثم قم بتفريغ المحلول باستخدام خط شلينك (Schlenk line) مع التحريك.

ارفع درجة الحرارة إلى 100 °C وقم بعملية التفريغ لمدة 15 دقيقة إضافية. لإزالة الشوائب ذات نقاط الغليان المنخفضة تحت غاز الأرجون، سخن الخليط إلى 300 °C لمدة ساعة واحدة لإذابة أكسيد الكادميوم تماماً. سيتغير لون المحلول من اللون المائل للاحمرار إلى شفاف وعديم اللون، ثم برد المحلول إلى درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، أضف HDA إلى محلول الكادميوم، وسخنه إلى 70 °C ثم قم بتفريغ الهواء. وبمجرد الوصول إلى ضغط ثابت، ارفع درجة الحرارة وقم بتكثيف المحلول بالارتجاع لمدة 30 دقيقة. ثم قم بتحويل صمام خط شلينك إلى الغاز الخامل وأدخل المزدوجة الحرارية مباشرة في المحلول.

في ظروف خالية من الهواء، أضف DPP إلى محلول الكادميوم وارفع درجة الحرارة إلى 310 degrees Celsius. الآن، استخدم محقنة بلاستيكية مخصصة للاستخدام مرة واحدة متصلة بإبرة قياس 16 لسحب 7.5 milliliters من محلول السيلينيوم العلوي بتركيز 0.4 molar. وبمجرد استقرار درجة الحرارة عند 310 degrees Celsius، اضبط وحدة التحكم في درجة الحرارة على zero degrees Celsius واحقن محلول السيلينيوم العلوي بسرعة ومباشرة في محلول الكادميوم.

سيتغير لون المحلول من عديم اللون إلى الأصفر ثم البرتقالي، وستنخفض درجة الحرارة بسرعة ثم ترتفع مرة أخرى لتصل إلى حوالي 280 degrees Celsius. وتتمثل الخطوة الأكثر صعوبة في هذا الإجراء في حقن كامل حجم المحقنة بأسرع ما يمكن في محلول الكادميوم، وذلك لضمان تنوي الجسيمات بشكل متجانس.

بعد مرور دقيقة واحدة من التفاعل، أخرج القارورة من غطاء التسخين وقم بتبريدها سريعاً بتيار من الهواء حتى تصبح درجة الحرارة أقل من 200 °C. وعندما تصل درجة الحرارة إلى 40 °C تقريباً، خفف المزيج بـ 30 mL من الهكسان، حيث سيترسب معظم ما تبقى من طليعة الكادميوم خارج المحلول. تخلص من هذه الرواسب عن طريق الطرد المركزي.

في كل أنبوب من ستة أنابيب طرد مركزي مخروطية من البولي بروبيلين سعة 50 milliliter، يتم تخفيف 12 milliliters من محلول nano Krystal الخام الناتج. وبإضافة 40 milliliters من الأسيتون، وبعد إجراء عملية الطرد المركزي بنفس المعلمات، يتم سكب supernatant بعناية والتخلص منه. بعد ذلك، تُذاب حبيبات nano krysttal في الهكسان.

استخلص المحلول بحجم مساوٍ من الميثانول مع الاحتفاظ بالطور العلوي. كرر عملية الاستخلاص هذه مرتين إضافيتين لإتمام الاستخلاص الثالث. يمكن تعديل حجم الميثانول إلى 15 milliliters تقريبًا للحصول على محلول مركز من الهكسان لنقاط كادميوم سيلينيد الكمية النقية بتركيز 200 micromolar تقريبًا.

الناتج النموذجي لهذا التفاعل هو بلورات سيلينيد الكادميوم بحجم ثلاثة ميكرومولار وبقطر يتراوح بين 2-3 نانومتر. حدد قطر وتركيز البلورات النانوية عن طريق قياس طيف الامتصاص للأشعة فوق البنفسجية والمرئية كما هو موضح في الإجراء المكتوب. يمكن استبدال البلورات النانوية جزئيًا بالزئبق لإحداث إزاحة حمراء في الامتصاص وانبعاث الفلورة. للقيام بذلك، امزج الهكسان والكلوروفورم في وعاء زجاجي سعة 20 مل يحتوي على قضيب تحريك، ثم أضف محلول النقاط الكمومية لسيلينيد الكادميوم OLA وأوكتانوات الزئبق. بعد تنقية البلورات النانوية وتحديد تركيزها كما هو موضح في الإجراء المكتوب، اترك البلورات النانوية لتتقادم لمدة 24 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة لنمو القشرة.

قم بتحضير محاليل سلائف القشرة بتركيز 0.1 مولار في دوارق ثلاثية العنق سعة 50 ميليلتر، وتحت تفريغ هوائي، قم بتسخين محاليل سلائف الكادميوم، وسلائف الزنك، وسلائف الكبريت حتى الارتجاع لمدة ساعة واحدة للحصول على محاليل رائقـة، ثم انقلها إلى دورق ثلاثي العنق مع الشحن بغاز الأرجون. أضف TOPO وODE ونقاط كمومية محضرّة من سيلينيد كادميوم الزئبق. قم بتفريغ الهكسين في درجة حرارة الغرفة باستخدام خط التفريغ.

ارفع درجة الحرارة إلى 100 °C واستمر في عملية التكثيف المرتد لمدة 15 دقيقة. قم بتحويل صمام الخط إلى غاز الأرجون وأدخل المزدوجة الحرارية في محلول nano Krystal. بعد رفع درجة الحرارة إلى 120 °C، أضف 0.5 طبقة أحادية أو 140 µL من محلول السلفور السلائف، واترك التفاعل يستمر لمدة 15 دقيقة.

ارفع درجة الحرارة إلى 140 °C. أضف 0.5 monolayer أو 140 µL من محلول سلف الكادميوم واترك التفاعل يستمر لمدة 15 دقيقة. ثم أضف 500 µL من OLA اللامائي إلى محلول التفاعل.

أضف عند درجة حرارة 160 °C مقدار 0.5 monolayers، أو 220 µL من محلول السلفور السلائف، يليه كمية مساوية من محلول الزنك السلائف عند درجة حرارة 170 °C مع فاصل زمنى قدره 15 دقيقة بين كل إضافة. بعد ذلك، وعند درجة حرارة 180 °C، أضف 0.25 monolayers، أو 150 µL من محلول السلفور السلائف ومحلول الزنك السلائف على فترات زمنية مدتها 15 دقيقة. بَرِّد المحلول إلى درجة حرارة الغرفة، ثم استخرج معامل امتصاص جديد لهذه الجسيمات.

باستخدام طيف الأشعة فوق البنفسجية والمرئية (UV vis)، وبافتراض أن عدد البلورات النانوية لم يتغير، تُحفظ محلول التفاعل كخليط خام في المجمد. في هذه المرحلة، يمكن توصيف البلورات النانوية باستخدام المجهر الإلكتروني، ومطيافية امتصاص الأشعة فوق البنفسجية والمرئية، ومطيافية الفلورية. تُضاف النقاط الكمومية ذات النواة والقشرة المنقاة إلى دورق ثلاثي العنق سعة 50 milliliter ويُزال الهكسين تحت فراغ عالٍ.

للحصول على غشاء جاف، املأ القارورة بغاز argonne. أضف purine اللامائي إلى غشاء الجسيمات النانوية وسخن المعلق إلى 80 °C على مدار ساعة إلى ساعتين. ستذوب الجسيمات النانوية تماماً.

أضف 1 mL من الجلسرول بتركيز 1 FIO إلى المحلول وقم بالتقليب عند درجة حرارة 80 °C لمدة ساعتين. بعد تبريد المحلول إلى درجة حرارة الغرفة، أضف 0.5 mL من ثلاثي إيثيل أمين لنزع البروتون من ثيوجلسرول والتقليب لمدة 30 دقيقة. قد يصبح المحلول عكراً بعد إضافة ثلاثي إيثيل أمين بسبب ضعف ذوبان البلورات النانوية القطبية في هذا المزيج من المذيبات.

انقل محلول النقاط الكمومية إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 milliliter يحتوي على خليط من 20 milliliters من الهكسان و20 milliliters من الأسيتون وامزجه جيداً. اعزل البلورات النانوية المترسبة عن طريق الطرد المركزي، يليه غسل الراسب بالأسيتون، ثم أذب راسب النقاط الكمومية في خمسة milliliters من DMSO باستخدام حمام سونيك (sonic bath) متبوعاً بالطرد المركزي. قم بذلك لإزالة التجمعات المحتملة، ثم حدد تركيز الجسيمات النانوية من خلال طيف امتصاص UV V.

يجب استخدام محلول النقاط الكمومية النقية في غضون ثلاث ساعات، حيث يمكن أن يتأكسد السطح ببطء تحت الظروف المحيطة في الهواء. خفف محلول النقاط الكمومية إلى 10 µM أو أقل باستخدام DMSO وانقله إلى دورق سعة 50 mL. أضف محلول حمض البولي أكريليك المخفف في DMSO، بتركيز 5 mg/mL، قطرة تلو الأخرى إلى محلول النقاط الكمومية مع التحريك، ثم قم بإزالة الغازات من المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

قم بتطهير محلول بوليمر النقاط الكمومية بغاز الأرجون وسخنه إلى 80 °C لمدة 90 دقيقة. بعد تبريد المحلول إلى درجة حرارة الغرفة، أضف حجماً مساوياً من صوديوم بتركيز 50 millimolar عند pH 8 قطرة بقطرة مع التقليب لمدة 10 دقائق. قم بتنقية النقاط الكمومية كما هو موضح في الإجراء المكتوب وحدد التركيز من طيف امتصاص UV vis؛ في قارورة زجاجية سعة 4 mL تحتوي على قضيب تقليب، اخلط 1 mole من النقاط الكمومية في محلول بورات منظم مع زيادة مولارية بمقدار 40,000 مرة من 750 Dalton mono amino polyethylene glycol.

يمكن العثور على التعليمات في الإجراء المكتوب حول كيفية إضافة وظيفة كيميائية محددة إلى البلورات النانوية. أضف بسرعة فائضاً مولارياً بمقدار 25,000 مرة من محلول عامل التنشيط الذي تم تحضيره حديثاً إلى محلول النقاط الكمومية، ثم قلبه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. كرر هذه الخطوة أربع مرات إضافية لإشباع سطح البلورة النانوية بـ PEG.

أخيرًا، أضف 200 µL من محلول tris المنظم بتركيز 1 M لإيقاف التفاعل قبل تنقية البلورات النانوية باستخدام مرشحات الطرد المركزي للدياليز أو الطرد المركزي الفائق. ويمكن تحليل البلورات النانوية الناتجة من حيث أحادية التشتت والحجم الهيدروديناميكي وشحنة السطح باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة، والترحيل الكهربائي للهلام، والمجهر الفلوري. يظهر هنا طيف امتصاص وفلورة ممثل لبلورات CdSe النانوية، والزئبق، والكادميوم، والسيلينيد، والبلورات النانوية بعد التبادل الكاتيوني، وبلورات ذات لب من HgCdSe وغلاف من CdZnS النانوية بعد نمو الغلاف. تمتلك بلورات CdSe النانوية اللبية حصيلة كمية للفلورة تقارب 15%، ومع ذلك، تنخفض هذه الكفاءة إلى أقل من 1% بعد تبادل الزئبق، ويرجع ذلك على الأرجح إلى مصائد حاملات الشحنة التي نشأت نتيجة اضطراب ذرات السطح.

إن نمو قشرة رقيقة من كبريتيد الكادميوم والزنك يرفع هذه الكفاءة إلى أكثر من 70%، وهي نسبة يتم الحفاظ عليها إلى حد كبير بعد النقل إلى الماء. وفي المقابل، فإن البلورات النانوية المكونة من نواة من سيلينيد الكادميوم وقشرة من كبريتيد الكادميوم والزنك دون دمج الزئبق تفقد جزءاً كبيراً من مردودها الكمي في الماء ما لم يتم نمو قشرة سميكة. ومن المهم ملاحظة أن التغطية بكبريتيد الكادميوم والزنك تؤدي إلى إزاحة الأطياف نحو اللون الأحمر بسبب تسرب حاملات الشحنة الإلكترونية إلى مادة القشرة.

يبلغ هذا الإزاحة حوالي 20 إلى 30 nanometers بالنسبة لنوى الكادميوم، وتزداد مع زيادة محتوى الزئبق في النواة. وهكذا، من خلال دمج الزئبق في البلورة النانوية للنواة، يمكن الحفاظ على الحجم الصغير للبلورة النانوية دون التضحية بالسطوع. ويتضح هذا الحجم الصغير في صورة المجهر الإلكتروني النافذ هذه وتوزيع حجم الجسيمات للبلورات النانوية المكونة من نواة من سيلينيد الكادميوم والزئبق وقشرة من كبريتيد الكادميوم والزنك، والتي تظهر متوسط قطر يبلغ 3.2 ± 0.6 nanometers.

يعد استخدام نقل طور ثنائي الخطوات إلى الماء أمراً بالغ الأهمية للحصول على مجموعة متجانسة من البلورات النانوية التي لا تتطلب مزيداً من فرز الحجم لإزالة العناقيد والتجمعات عبر استبعاد الحجم. ويؤكد المخطط الكروماتوغرافي الموضح هنا أن الحجم مشابه لحجم con albumin. فعند 75 kilodaltons وبعد التعديل باستخدام amino PEG بوزن 750 Dalton، يزداد الحجم إلى 12 nanometers فقط، وهو حجم مشابه لحجم جسم مضاد IgG.

يعمل تعديل PEG على تحييد شحنة السطح كما تم التأكيد عليه في تجربة الفصل الكهربائي للهلام في الوسط المكتنز (agarose gel electrophoresis) الموضحة هنا؛ حيث تم تحديد البئر بسهم، بينما أشير إلى قطبية الأقطاب الكهربائية على اليمين، مما يظهر أن البلورات النانوية تهاجر كجسيمات أيونية قبل الاقتران، وأن البلورات النانوية المـpegylated محايدة كهربائياً. يظهر هنا مجهر فلوري انعكاسي (epi fluorescence micrograph) لهذه البلورات النانوية المترسبة على شريحة غطاء زجاجية والمثارة بضوء مرئي بطول موجي 545 nanometer. يمكن ملاحظة هذه البلورات النانوية بسهولة على مستوى الجزيء الواحد بمعدل 30 frames per second باستخدام كاميرا CCD مضاعفة للإلكترونات.

يوضح هذا المخطط أن عدد الجسيمات الفلورية المرصودة في كل إطار يتذبذب بمرور الوقت مع استمرار الاستثارة. ويعود ذلك إلى مزيج من الوميض والتحلل الضوئي. ويسود الوميض خلال الدقائق السبع الأولى قبل أن يبدأ التحلل الضوئي التأكسدي في الظهور ببطء.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التخليق الكيميائي للنقاط الكمومية، وكيفية نقلها إلى محاليل منظمة مائية، وكيفية تعديلها لتطبيقات التصوير الحيوي. لا تنسَ أن العمل مع الكواشف التي تحتوي على الكادميوم والزئبق يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا يجب اتخاذ احتياطات إضافية لمنع التعرض الشخصي.