قياس تأثيرات على الأجسام المضادة من وظيفة الخلوية Cardiomyocytes متفرقة

يتمثل الهدف العام للتجربة التالية في الكشف عن الأجسام المضادة الموجهة للقلب في بلازما المرضى الذين يعانون من اعتلال عضلة القلب التوسعي أو أمراض القلب الأخرى ذات الخلفية المناعية الذاتية. ويتحقق ذلك من خلال إجراء امتصاص مناعي مصغر أولي لبلازما المريض على أعمدة كروية مضادة لـ IgG لتنقية الغلوبولين المناعي G كخطوة ثانية. يتم عزل الخلايا العضلية القلبية البطينية من جرذان wistar البالغة لتوفير القاعدة الخلوية لهذا المقايسة الحيوية.

بعد ذلك، تُترك الخلايا العضلية القلبية لتلتصق بشرائح غطاء الحجرة وتُصبغ بـ URA 2:00 AM لتمكين مراقبة العبور المؤقت للكالسيوم داخل الخلايا أثناء الانقباضات، ثم يتم اختبار IgG الخاص بالمريض لملاحظة تأثيره على قدرة الخلايا العضلية القلبية على الانقباض. وتوضح النتائج ما إذا كان IgG المريض يحتوي على أجسام مضادة توجيهية بناءً على التغيرات في الانقباضية والعبور المؤقت للكالسيوم في الخلايا العضلية القلبية المعزولة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل المقايسات المناعية القياسية للكشف عن الأجسام المضادة، في أنها مستقلة عن مستضد معين وتسمح بالتمييز بين الأجسام المضادة المحفزة والأجسام المضادة الحاجبة.

سيتم عرض الإجراء من خلال Google وبدعم فني من مختبرنا. لبدء هذا الإجراء، قم بتجهيز أعمدة الامتصاص المناعي الصغيرة عن طريق ملء ثلاثة مليلتر من anti IgG spheros لكل مليلترين من بلازما المريض EDTA في عمود econopak فارغ. بعد ذلك، ضع مرشحاً فوق الـ anti IgG spheros.

اقطع الطرف السفلي للعمود واضغط على المرشح للوصول إلى معدل تدفق يبلغ تقريبًا قطرة واحدة في الثانية. بعد ذلك، اغسل العمود ثلاث مرات بحجم واحد من البلازما باستخدام 0.9% Sodium chloride، ثم انقل البلازما إلى العمود بواسطة الماصة، وعندما تنغمر البلازما تمامًا في anti IgG Spheros، اغسلها بنفس الحجم من 0.9% sodium chloride. بعد ذلك، انقل حجمًا واحدًا من البلازما من 0.2 molar glycine hydrochloride عند pH 2.8 إلى العمود واتركه ينغمر في الحبيبات.

ثم أضف حجماً آخر من هيدروكلوريد الجلايسين إلى العمود. اجمع التدفق في أنبوب سعة 15 milliliter واضبط الـ pH إلى 7.3 باستخدام 0.5 molar tris hydrochloride عند pH 8.0 لإعادة تنشيط العمود. اغسله بثلاثة أحجام من البلازما من هيدروكلوريد الجلايسين بعد غسلة نهائية بحجمين من 0.9% sodium chloride.

يمكن استخدام العمود لعينة البلازما التالية المخصصة للاستخدام على الخلايا العضلية القلبية. يجب إجراء ديالة لجزء IgG الذي تم جمعه مقابل محلول منظم تجريبي (experimental buffer)، وذلك أولاً بملء جزء IgG في أنبوب غشاء ديالة من إستر السليلوز بحد قطع للوزن الجزيئي يبلغ 100 kilodaltons. بعد ذلك، يُوضع الأنبوب في لتر واحد من EB ويُقلب ببطء باستخدام محرك مغناطيسي عند درجة حرارة أربعة degrees Celsius. وبعد ثماني ساعات، يُنقل أنبوب الديالة إلى ثلاثة لترات من EB الطازج وتُجرى الديالة لمدة 20 ساعة أخرى عند درجة حرارة أربعة degrees Celsius.

اغلِ العينة لمدة 30 دقيقة عند 57 °C في حمام مائي. ولتعطيل عوامل المتممة، حدد تركيز IgG الكلي وجهز حصصاً تحتوي كل منها على 330 µg من IgG. وفي هذا الإجراء، جهز محلول عزل خالٍ من الكالسيوم وفقاً للمخطوطة المرفقة.

بعد ذلك، املأ الخزان العلوي لنظام التروية لانور (lanor) ذو المنظم الحراري بـ 80 milliliters من IB، وحافظ على المحلول المنظم عند 37 degrees Celsius مع تهويته بـ 95%oxygen و 5%carbon dioxide لمدة 30 دقيقة. أذب ما يقرب من 7,000 إلى 10,000 units من collagenase type two و 174 milligrams من BSA الخالي من الأحماض الدهنية في 20 milliliters من IB الذي يحتوي على 112.5 micromolar من كلوريد الكالسيوم، واضبط قيمة pH لمحلول العزل المنظم في الخزان العلوي إذا لزم الأمر.

بعد ذلك، قم بتخدير جرذ من سلالة wistar يتراوح وزنه بين 175 إلى 200 grams باستخدام thiopental بجرعة 375 micrograms per kilogram مع إضافة 2, 500 IU من heparin إلى محلول thiopental. بعد إجراء عملية بضع الصدر، استأصل القلب بعناية مع الحفاظ على قوس الأبهر سليماً وانقله إلى محلول sodium chloride بتركيز zero point percent مبرد بالثلج. قم بإزالة الدم والأنسجة المحيطة بالقلب.

بعد ذلك، انقلها إلى محلول كلوريد الصوديوم 0.9% طازج وكشف الشريان الأورطي. قم بتشغيل مخفض التدفق في نظام langor للحصول على سرعة تنقيط تتراوح بين نقطتين إلى ثلاث نقاط في الثانية. ثم قم بتوصيل القلب بالقنية.

قم بإجراء التروية لمدة تصل إلى ثلاث دقائق بمعدل تدفق قدره قطرة واحدة في الثانية لغسل الدم المتبقي. بعد ذلك، قم بتدوير IB في نظام LOR. والآن، اسحب 20 milliliters من المحلول المنظم من الخزان العلوي.

املأ الخزان بمحلول الكولاجيناز وأضف كمية المحلول المنظم اللازمة للوصول إلى 80 milliliters. بعد ذلك، قم بتدوير محلول الهضم لمدة 27 دقيقة أخرى. ثم افصل القلب عن القنية.

قم بإزالة الأذينين والشريان الأورطي، ثم قطع البطينين إلى قطع صغيرة. اترك محلول الهضم يتدفق إلى الخزان السفلي. قلل الحجم إلى 40 milliliters كحد أقصى لمواصلة هضم البطينين المقطعة لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة تحت تهوية مستمرة بـ 95%oxygen و 5%carbon dioxide.

بعد ذلك، قم بترشيح معلق الخلايا عبر شاش بحجم مسام 200 micron في أنبوب سعة 50 milliliter. وأخيرًا، استعد محتوى الكالسيوم في الخلايا عن طريق طرد معلق الخلايا مركزياً عند 40 3G لمدة دقيقتين. وفي درجة حرارة الغرفة، أعد تعليق الخلايا في 10 milliliters.

يتم طرد الـ IB الذي يحتوي على 200 micromolar من كلوريد الكالسيوم مركزياً مرة أخرى، ثم يتم إعادة تعليق الخلايا في 10 milliliters من الـ IB الذي يحتوي على 500 micromolar من كلوريد الكالسيوم. وبعد عملية طرد مركزي نهائية، يتم إعادة تعليق الخلايا العضلية القلبية في EB مفلتر ومعقم لتصل الكثافة إلى 50,000 cells per milliliter.

قم بطلاء شرائح التغطية في غرفة ذات أربعة آبار بـ 10 micrograms من اللامينين لكل بئر، وانتظر حتى تجف تماماً. بعد ذلك، قم بتعبئة واحد milliliter من معلق الخلايا العضلية القلبية في كل بئر. باستخدام ماصة دقيقة ذات طرف مقصوص، اترك الخلايا تلتصق لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ثم خفف 10 microliters من المحلول المخزون من fira 2:00 AM بتركيز واحد milligram per milliliter في خمسة milliliters من eb، واحفظ محلول الصبغ في الظلام.

بعد ذلك، قم بإزالة المحلول المنظم والخلايا غير الملتصقة من شرائح التغطية، ثم أضف بواسطة الماصة 0.5 milliliters من محلول التلوين. قم بتحضين الخلايا في كل بئر لمدة 10 دقائق تحت رج متوسط. بعد ذلك، قم بإزالة محلول التلوين واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1 milliliter من eb.

بعد ذلك، أضف 0.5 milliliters من EB إلى كل بئر في هذا الإجراء، وضع غطاء الزجاج تحت مجهر فلوري مقلوب متصل بنظام تسجيل كالسيوم وانقباض الخلايا العضلية القلبية. ضع قطباً كهربائياً مصنعاً خصيصاً مع أنبوب تدفق ودفق في البئر الأول، ثم قم بتروية الخلايا العضلية القلبية بمعدل one milliliter per minute من EB.

ابدأ التحفيز الكهربائي بجهد 20 volts، وبتردد 1 hertz، ومدة 5 milliseconds لكل نبضة، واترك الخلايا تتكيف مع التحفيز لمدة دقيقتين تقريبًا. اختر خلية عضلية قلبية سليمة عصوية الشكل ذات تخطيط واضح وانقباض مستمر، وضعها في مركز المجال البصري. بعد ذلك، افتح قناة الكاميرا ووجّه الخلية أفقيًا داخل منطقة الفيديو عن طريق تدوير محول تأطير الخلية وتحريك منصة المجهر.

قم بضبط حدود عناصر التحكم في الكشف لمنطقة الفيديو. قم بتشغيل القناة الفلورية وسجل من 10 إلى 15 انقباضاً للحصول على القصر الأولي للخلية وعابر الكالسيوم. بعد ذلك، قم بإيقاف تشغيل قناة ضوء المجهر لتجنب بهتان الصبغة الفلورية.

قم بتحويل تدفق السائل من EB إلى مسار تجاوز العينة باستخدام صمام ثلاثي الاتجاهات، ثم قم بدمج الخلايا العضلية القلبية باستخدام 1 mL من IgG الخاص بالمريض. أوقف المضخة قبل وصول الهواء إلى البئر مباشرة، ثم قم بتشغيل القناة الضوئية وسجل من 10 إلى 15 انقباضًا إضافيًا للحصول على الاستجابة الخلوية الحادة. بعد ذلك، أوقف التسجيل وأغلق القناة الضوئية مرة أخرى، وكرر التسجيلات بعد دقيقتين وخمس دقائق، ثم اسحب القطب الكهربائي من البئر عند الانتهاء. في النهاية، قم بتحليل تقصير الخلية والعابر الكالسيومي باستخدام برنامج ion wizard، وذلك باستخدام نافذة edge length/length وURA two numeric subtracted/ratio على التوالي.

بعد ذلك، احسب النسب المئوية للتغيرات في الاستجابات الحادة، واستجابة الدقيقتين، واستجابة الخمس دقائق مقارنة بتقلص الخلية الأولي والارتفاع الذروي للعابر الكالسيومي. فيما يلي مثال نموذجي لقياس المجموعة الضابطة. تمت مراقبة تقلص الخلية والعابر الكالسيومي مباشرةً قبل الإرواء بـ IgG، وبعد دقيقتين وخمس دقائق مباشرةً من الإرواء بـ IgG.

وفيما يلي مثال على قياس عينة IgG تحتوي على أجسام مضادة مثبطة لعضلة القلب. تم قياس تقصير الخلية والعبور الكالسيومي بشكل مباشر قبل التروية السطحية بـ IgG، وبعد دقيقتين وخمس دقائق مباشرة من التروية السطحية بـ IgG. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الكشف عن الأجسام المضادة المثبطة للقلب في بلازما المريض عن طريق قياس تأثير IgG المعزول على تقصير الخلية والعبور الكالسيومي في خلايا عضلة القلب البطينية المعزولة من البالغين.