الجهد حساسة من تسجيل صبغ محاور عصبية، التشعبات والعمود الفقري شجيري الخلايا العصبية الفردية في شرائح الدماغ

الهدف العام من التجارب الموصوفة هو مراقبة تكامل إشارات جهد الغشاء ومعالجة المعلومات بواسطة خلية عصبية فردية بصرياً، وبدقة تقل عن الميكرومتر والميلي ثانية من مواقع متعددة على العصبون. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال بناء نظام تصوير يتمتع بالحساسية المناسبة للسماح بتسجيل التغيرات الجزئية الصغيرة في شدة الضوء المقابلة للعابر في جهد الغشاء. بعد ذلك، يتم اختيار العصبونات ذات التشريح المناسب للتصوير الفعال، وهي العصبونات ذات الزوائد الطويلة السليمة في مستوى بؤري واحد بالقرب من سطح الشريحة.

بعد ذلك، يتم تحميل الخلايا العصبية المختارة مسبقاً بصبغات حساسة للجهد للسماح بالتتبع البصري لتغيرات جهد الغشاء. وتظهر النتائج القدرة الفريدة لهذا النهج على الحصول على معلومات حول تكامل الإشارات الكهربائية بواسطة الخلايا العصبية الفردية من خلال مراقبة إشارات جهد الغشاء من المحاور، والتغصنات، والشوك التغصنية. في الفسيولوجيا العصبية الخلوية.

يتم حالياً تطوير أدوات جديدة بسبب وجود قيدين طويلين الأمد في الفيزيولوجيا الكهربائية التقليدية، وهما: انخفاض الدقة المكانية لقياسات الأقطاب الكهربائية، وعدم القدرة على التسجيل من الهياكل الصغيرة مثل الشجيرات المحورية أو الأشواك التغصنية. وللتغلب على هذه العيوب، يمكن دمج نهج القطب الرقعي (patch electrode) مع تقنيات بصرية تسمح بإجراء تسجيلات متوازية من جميع أجزاء العصبون. نصف هنا هذه التقنية، وهي التسجيل البصري الجانبي المتعدد لعمليات انتقال جهد الغشاء بدقة الشوكة الواحدة.

في هذه التجربة، يتم استخدام مجهر رأسي وثلاث كاميرات لضبط الإضاءة الموحدة. أولاً، أدخل مرشح كثافة محايدة مناسب في مسار شعاع الليزر. بعد ذلك، قم بتركيز العدسة الشيئية على سطح الشريحة الفلورية القياسية.

أثناء مراقبة صورة CCD لمجال الرؤية على شاشة الشاشة، قم بضبط موضع الطرف المستقبل لدليل الضوء الكوارتزي وموضع الطرف المخرج لدليل الضوء باستخدام المشغلات المناسبة في مكثف الفلورسنت فوق البؤري (epi fluorescence condenser) من أجل تحقيق إضاءة مركزة وموحدة لمجال الرؤية. ولتحديد ضوضاء الاهتزاز، استخدم شريحة فلورسنت قياسية تحتوي على علامة غير فلورية على السطح. قم بتسجيل شدة الضوء باستخدام neuro CCD في الوضع المستمر.

قم بتركيز الشيئية على حافة مظلمة من العلامة السوداء وسجل شدة الضوء لمدة 100 milliseconds تقريبًا بمعدل إطارات يبلغ two kilohertz. ثم اعرض المتوسط المكاني لآثار شدة الضوء الكسرية من حوالي 20 بكسل تستقبل الضوء من المنطقة المضاءة بشكل منتظم ومن حوالي 20 بكسل على طول حافة العلامة السوداء. تعكس الضوضاء الزائدة في المتوسط المكاني للبكسلات ذات الحواف عالية التباين الضوضاء الاهتزازية في النظام.

من الضروري تركيب الغالق الميكانيكي بعيداً عن طاولة عزل الاهتزازات لضمان عدم تسبب فتح الغالق في إدخال ضوضاء اهتزازية في التسجيل البصري، وتعد هذه الخطوة حاسمة. قم بتركيب الغالق باستخدام براغي بلاستيكية ومواد عازلة للاهتزاز لتقليل ضوضاء الاهتزازات الصوتية التي يمكن أن يلتقطها نظام التسجيل البصري.

لعزل الاهتزاز، قم بضبط طاولة عزل الاهتزازات حتى يصبح ضجيج الاهتزاز في البكسلات التي تغطي الحافة الحادة للصورة أقل من ضجيج الطلقة (shot noise). يجب أن تكون أسلاك المعدات الموجودة على الطاولة مرتخية لتجنب نقل الاهتزازات الميكانيكية إلى منظار المجهر. في هذا الإجراء، قم بتحضير شرائح دماغية بسمك يتراوح من 300 إلى 400 micron وفقاً للإجراءات القياسية باستخدام سلالة من الفئران تعبر عن EGFP في الخلايا العصبية الفردية المستهدفة باستخدام نظام مجهر كونفوكال ذو القرص الدوار (spinning disc confocal system).

قم بتصور العصبونات الموُسمة بـ EGFP في الشريحة. بعد ذلك، اختر العصبونات ذات الأشجار التغصنية والمحورية السليمة، والتي تمتد استطالاتها بشكل موازٍ وقريب من سطح الشريحة لتصوير جهد الغشاء. ثم املأ ماصة رقعة زجاجية من الطرف بمحلول داخل خلوي خالٍ من الصبغة حتى ثلثي تضيق القطب الكهربائي عن طريق تطبيق ضغط سلبي لمدة 15 ثانية تقريبًا.

بعد ذلك، املأ القطب الكهربائي مجدداً بالمحلول الذي يحتوي على صبغة الجهد الحساسة للنفاذية الغشائية IMP المذابة في المحلول داخل الخلوي. الآن، قم بعمل تثبيت الرقعة (patch) لخلية عصبية مختارة مسبقاً خلال دقيقة واحدة من تحميل الصبغة في القطب الكهربائي. طبق ضغطاً موجباً منخفضاً يبلغ حوالي 10 millimeters of mercury قبل خفض الماصة إلى الحمام، وأثناء وضع القطب الكهربائي في الشريحة؛ يضمن ذلك عدم تسرب الصبغة من القطب الكهربائي قبل تكوين الختم.

ارفع الضغط إلى قيمة عالية تصل إلى 100 millimeters of mercury مباشرة قبل ملامسة القطب لسطح الخلية. بعد إتمام عملية الختم في تكوين الخلية الكاملة، اترك صبغة التلوين تنتشر بحرية من ماصة الرقعة الجسدية إلى جسم الخلية لمدة تتراوح بين 20 و45 دقيقة. وأثناء انتشار الصبغة، راقب الحالة الفسيولوجية للعصبون عن طريق تسجيل جهود الفعل المستثارة في وضع تثبيت التيار.

بالإضافة إلى ذلك، راقب كمية الصبغ عن طريق تسجيل شدة الضوء في حالة الراحة من جسم الخلية بمعدل إطارات يبلغ 2 kHz وبجزء من شدة الضوء الكاملة يتم ضبطه باستخدام مرشحات الكثافة المحايدة. استمر في عملية التنزيل حتى يبدأ جهد الفعل في الاتساع. في نهاية عملية الصبغ، اسحب الماصة الرقعية بعناية بعيداً عن جسم الخلية في وضع تثبيت الجهد لضمان تحقيق الانتقال من وضع الخلية الكاملة إلى وضع الرقعة الخارج-خارج خلال هذه العملية.

ثم يتم تحضين الشريحة لمدة إضافية تتراوح من 1.5 إلى ساعتين في درجة حرارة الغرفة للسماح لصبغة الجهد بالانتشار إلى الاستطالات العصبية. وبعد انتشار كمية كبيرة من الصبغة بعيداً عن جسم الخلية إلى الاستطالات الشجيرية والمحوارية، يجب أن يستعيد جهد الفعل شكله الموجي بالكامل. في الخطوة التالية، حدد موقع جسم الخلية العصبية المصبوغة تحت الفلورة منخفضة الكثافة.

قم بخفض شدة الضوء باستخدام مرشحات الكثافة المتعادلة إلى الحد الأدنى المطلوب لرؤية الجسم المستهدف باستخدام منصة XY. امسح منطقة الشريحة التي تحتوي على العصبون الفلوري حتى يتم تحديد جسم الخلية الفلوري. ضع جسم الخلية المصبوغة في مركز مجال المجهر، ثم قم بعمل رقعة للعصبون باستخدام قطب رقعة قياسي بدون صبغة تحت نظام تباين التداخل التفاضلي (DIC). بعد ذلك، قم بمعاينة الاستطالات العصبية تحت الفلورية منخفضة الشدة بمعدل إطارات يتراوح من 10 إلى 40 هرتز في وضع التسجيل المستمر لجهاز CCD من أجل تصوير الجهد الكهربائي.

باستخدام منصة تحريك XY، قم بوضع الاستطالة العصبونية المستهدفة في منتصف منطقة التصوير. بالإضافة إلى ذلك، قم بحماية جسم الخلية (SOMA) من ضوء الاستثارة باستخدام قرص حجب المجال المغلَق جزئيًا في المجهر لتقليل الضرر الديناميكي الضوئي. بعد ذلك، قم بتسجيل الإشارات البصرية المتعلقة بجهد الفعل المرتد في التفرعات الشجيرية الفردية.

ثم قم بتسجيل الإشارات الضوئية المتعلقة بجهود الفعل في المحوار. بعد ذلك، سجل الإشارات الضوئية المتعلقة بجهود الفعل المرتجعة في الأشواك الشجيرية. استخدم معدل الإطارات المناسب لإعادة بناء دقيقة لشكل موجة الإشارة.

في الوقت ذاته، حافظ على فترات التسجيل والتعرض لضوء الإثارة عالي الكثافة أقصر ما يمكن، وذلك لتقليل بهتان الصبغة والضرر الناتج عن التأثيرات الضوئية الديناميكية. يُعرض هنا تسجيل الإشارات الضوئية. يوضح اللوح العلوي صورة مجهرية بؤرية عالية الدقة لخلية عصبية مصبوغة مع محورها العصبي في وضعية التسجيل.

بينما تُظهر اللوحة الوسطى صورة فلورية منخفضة الدقة المكانية للمحور العصبي تم الحصول عليها بواسطة CCD المستخدم لتصوير جهد الغشاء، تُقدم اللوحة السفلية تسجيلات القطب الكهربائي من جسم الخلية والتسجيلات الضوئية من A IS وعقدة rvi. وتظهر هنا البيانات الخام والإشارات المعالجة. يوضح هذا الشكل إشارات جهد الفعل من محور عصبون قشري L five محمل بصبغة حساسة للجهد action.

سُجلت الإشارات المحتملة ذات الصلة بمعدل إطارات بلغ 10 kilohertz. وتشير هذه التتبعات إلى جهد الفعل العابر من ثلاثة مواقع. أولاً، القطب الكهربائي الذي يسجل من جسم الخلية.

ثانياً، التسجيلات البصرية من التل المحوري، وثالثاً، التسجيل البصري من أول عقدة من vie، وهنا تظهر الإشارات المتراكبة من المواقع الثلاثة نفسها. يوضح هذا الشكل دفقاً من أربع إشارات جهد فعل عكسية الانتشار من مواقع متعددة على التشجر الشجيري لعصبون قشري L 5، تم تحفيزها بنبضات تيار مزيلة للاستقطاب قصيرة بتردد 100 hertz. تظهر هنا إشارات جهد الفعل من شوكة شجيرية فردية.

إليك إعادة البناء التشريحي الذي تم الحصول عليه من مجموعة من صور المجهر البؤري ذي القرص الدوار، وهنا صورة الفلورية للمنطقة نفسها التي تم الحصول عليها بواسطة كاميرا CCD. ولتصوير جهد الغشاء، تظهر في اللوحة اليمنى مخططات شدة الفلورية المقابلة لجهد الفعل الرجعي من المواقع من واحد إلى ثلاثة كما هو موضح في صورة CCD. ويشير المخطط السفلي إلى تسجيل القطب الكهربائي من جسم الخلية.

تستغرق عملية التحضير قبل التسجيل حوالي ثلاث ساعات، بما في ذلك فترة الانتظار حتى ينتشر الديس (dice) إلى العمليات الطرفية. ووقت التسجيل محدود بالتدهور الطبيعي للتحضير وبالضرر الضوئي الديناميكي الناتج عن PO. وتتناسب كمية الضرر الضوئي الديناميكي طرديًا مع شدة ضوء الاستثارة، ومع مدة وعدد تجارب التسجيل الفردية.

في بعض التجارب، يمكن إجراء أكثر من 50 محاولة تسجيل على مدار ساعة أو ساعتين. بينما تتطلب قياسات أخرى إثارة عالية وكثافات ضوئية وتسجيلات أطول، وتكون محدودة بعدد قليل من محاولات التسجيل فقط بسبب التلف الديناميكي الضوئي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تصوير الجهد الكهربائي من كامل المحور العصبي وبنية النهايات العصبية للعصبونات الفردية في شرائح الدماغ.