A وصف البصرية في تشريح الأوعية الدموية السطحية والسحايا الدماغي المقترن والضفيرة المشيمية من دماغ الفئران

الهدف العام من هذا الإجراء هو تشريح أجزاء القشرة والعنكبوتية من السحايا والأوعية الدموية الشريانية المرتبطة بها بكفاءة وسرعة، والتي تغطي سطح قشرة الدماغ الأمامي والدماغ المتوسط والمهاد والجسور، بالإضافة إلى استخراج الضفيرة المشيمية من البطينات الجانبية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إزالة الغدة الصنوبرية وفصل السحايا والشجيرات الشريانية الملاصقة للدماغ الأمامي. ثانياً، يتم إزالة الشرايين والشريينات الموجودة على السطح القشري بعناية، بدءاً من دائرة ويليس البطنية، ثم الانتقال إلى الأسطح القشرية الظهرية بحيث تظل القشرة وأغشية العنكبوتية المتبقية متصلة بالأوعية الدموية، مع الحرص على تقليل استخراج أنسجة السطح القشري المجاورة.

بعد ذلك، يتم تشريح القشرة والألياف الصوارية بعيداً عن الحاجز والسماخ، مما يكشف عن البطينات الجانبية للسماح بحصاد الضفيرة المشيمية. وأخيراً، يتم إزالة السماخ، مما يكشف عن المهاد ومسارات الجسم الثفني في الدماغ المتوسط. ثم يتم تشريح السحايا والأوعية الدموية المرتبطة بها والتي تغطي هذه المنطقة.

في النهاية، يمكن تحديد سلامة وخصوصية السحايا المُشرحة والأوعية الشريانية المرتبطة بها، بالإضافة إلى الضفيرة المشيمية، من خلال مقارنة ملفات التعبير الجيني لكل منطقة من هذه المناطق. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في الأبحاث المتعلقة بالأوعية الدموية التي تدعم وظائف الدماغ. ويتضمن ذلك دراسة التشابهات والمقارنات والاختلافات في وظيفة الضفيرة المشيمية مقارنة بالسحايا وأوعيتها الشريانية المرتبطة بها فيما يتعلق بتدفق الدم، ووظيفة السائل الدماغي النخاعي (CSF)، والإصابات السامة للأعصاب، وصدمات الدماغ.

لبدء هذا البروتوكول، توضع الأدمغة التي استُخرجت للتو من الجرذان مباشرة بعد القتل الرحيم في محلول ملحي طبيعي بارد جداً (في الثلج) لمدة خمس دقائق. من المهم ترك الدماغ يبرد لهذه المدة قبل التشريح لضمان إمكانية فصل السحايا الدماغية الأربع والأوعية الدموية الشريانية المرتبطة بها (MAV) عن سطح القشرة المخية. بعد ذلك، يُوضع الدماغ في قاع طبق بتري زجاجي مستقر على الثلج مع إضافة 1 cm من المحلول الملحي الطبيعي البارد جداً أو محلول صوديوم فوسفات المنظم بتركيز 0.1 molar وبدرجة pH 7.4.

يجب إجراء جميع عمليات التشريح مع غمر الدماغ في المحلول الملحي في أغلب الأوقات. لبدء التشريح، ضع الدماغ في طبق بتري بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى، وحدد موقع الغدة الصنوبرية، والتي تقع في المنطقة البطنية الأكثر وسطية بين نصفَي الكرة المخية. تقع الغدة في المنطقة المنقارية بالنسبة للمخيخ مباشرةً، وأسفل السحايا مباشرةً أو عند سطحها.

فوق التلال (colli). قم بإزالة الغدة الصنوبرية باستخدام ملقطين صغيرين ذوي رؤوس منحنية. لاحظ أن الغدة الصنوبرية وردية اللون مثل القشرة، ولكنها غالبًا ما تكون محاطة ببقايا دم وأوعية دموية متبقية من عملية إزالة الدماغ.

بعد ذلك، اقلب الدماغ رأساً على عقب في طبق بتري. ثم افصل الشريان الفقري والشرايين الأصغر والسحايا التي تغطي الجسر عن السحايا والأوعية الدموية في الدماغ الأمامي. بعد ذلك، ابدأ في إزالة MAV.

من المهم البدء من الناحية البطنية في عملية التشريح بالشرايين الرئيسية لدائرة ويليس، وهي الشرايين الدماغية الوسطى والشرايين الأمامية. بعد ذلك، وبدءاً من أي من نصفي الكرة المخية، استخدم ملاقط صغيرة ذات طرف منحني لقطع الشريان الموصل الخلفي خلف ملتقى الشريان السباتي الداخلي مباشرةً، وبذلك يتم فصل الأشجار الشريانية الأمامية والخلفية للدماغ الأمامي. ثم كرر العملية نفسها للنصف المقابل من الكرة المخية.

الآن، وبالإمساك بالشريان السباتي الأوسط (MCA) والشريان الأمامي باستخدام الملقط، اسحبهما برفق في اتجاه ظهري أمامي بحيث يتم رفع التشوه الشرياني الوريدي (MAV) الذي يغطي القشرة الأمامية البطنية فوق وحول السبل olfactory tract. يؤدي ذلك إلى إزالة جزء كبير من الـ MAV الذي يغطي القشرة الأمامية. أدر الدماغ بزاوية 45 إلى 90 درجة بالنسبة لطبق بتري بحيث يمكن تحرير المناطق الجانبية الأكثر أمامية من الـ MAV المحيطة بالمناطق القشرية الجانبية من القشرة، ثم أمسك بالـ MCA والشرايين المرتبطة به واسحبها برفق في الاتجاه الظهري على طول القشرة.

إذا لزم الأمر، يمكن استخدام طرفي الملقط لرفع الشرايين الرئيسية وتحريرها من القشرة الدماغية أثناء عملية التشريح. الآن، قم بإزالة المناطق الجانبية الأكثر خلفية من الـ MAV. لاحظ أنه من الأفضل التبديل بين نصف كرة دماغي والآخر خلال عملية الحصاد هذه لضمان بقاء الـ MAV باردًا ورطبًا، كما يجب التبديل بين نصفي الكرة الدماغية في حال مواجهة أي مقاومة عند تحرير الـ MAV من القشرة الدماغية.

وأخيراً، لإزالة أكثر المناطق الظهرية من الـ MAV المحيطة بالقشرة الحسية الجسدية والقشرة الحركية الأولية، اقلب الدماغ بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى لتحرير هذا القسم من الدماغ، واستخدم أطراف الملقط على طول الجيب السهمي. يمكن إما الاحتفاظ بهذا الجزء من الـ MAV المستخلص مؤقتاً في محلول ملحي مبرد بالثلج حتى يحين موعد الاختبار والتحليل، أو تجميده للمعالجة لاحقاً. وغالباً ما يظل الـ MAV الذي يغطي أكثر المناطق القشرية خلفية التصاقاً.

يتم عرض عملية إزالته في قسم لاحق من هذا الفيديو. لإزالة الضفيرة المشيمائية، ضع الدماغ أولاً بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى وثبته في مكانه باستخدام الملقط الأكبر. ثم ادفع الملقط الأصغر لأسفل عبر الخط المتوسط بين نصفي الكرة المخية واستخدم طرفيه للثقب عبر القشرة والجسم الثفني وصولاً إلى الجزء العلوي من الخط المتوسط للحصين.

بعد ذلك، استخدم الملقط لسحب القشرة مع الجسم الثفني بعيدًا عن الحصين الظهري والحاجز، مما يكشف معظم البطين الجانبي. يمكن تحديد موقع الضفيرة المشيمائية والتعرف عليها من خلال الخط الأحمر المتموج الذي يحدد الشريان الرئيسي الذي يمتد على طولها. استخدم طرفي الملقط لمباعدة الجدران الجانبية للبطين الثالث وتوسيعه عند طرفه الأكثر ضيقاً.

بعد ذلك، وباستخدام الملقط الصغير، اسحب هذا الطرف من الضفيرة المشيمية لتحريره. تالياً، استخدم الملقط لتوسيع المنطقة الأمامية القصوى بين الحاجز ومنطقة النواة المخططة الذيلية، واسحب الضفيرة المشيمية لتحريرها من هذا الطرف أيضاً. قم بإجراء نفس العملية على نصف الكرة المخية المقابل للحصول على الضفيرة المشيمية الثانية المتبقية.

مرة أخرى، يمكن حفظ هذا النسيج مؤقتًا في الثلج، أو في محلول ملحي بارد، أو تجميده للمعالجة لاحقًا. لإزالة ما تبقى من MAV الذي يغطي أكثر المناطق الخلفية من القشرة المخية، قم أولاً بإزالة الحصين بالكامل من كلا نصفي الكرة المخية، مما يكشف عن MAV فوق المهاد والأكيمة. لاحظ أن إزالة هذا الجزء من MAV ستكون أقل صعوبة بكثير من إزالته من القشرة المخية بالنسبة لما تبقى من MAV.

من خلال الإمساك بالأوعية الدموية الأكبر التي تغطي الجزء الأمامي من المهاد والسحب بلطف، يتضح أن هذه الأوعية متصلة بالشبكة فوق الحزامية وتمد الحصين الظهري وشبكة المهاد الظهري بالدم. يتم السحب بعيداً حتى تتحرر الشبكة العليا في النهاية، ومن ثم يمكن الوصول إلى الأجزاء الأخيرة من الدائرة الشريانية. وفي هذه المرحلة، يجب توخي المزيد من الحذر لإزالة أي تشوه شرياني وريدي (MAV) متبقٍ على سطح القشور السمعية والبصرية والأولية والخطية الرجعية الحبيبية.

يجب إزالة أي جزء متبقٍ من الـ MAV القشري البطني الخلفي الذي تم حصاده مع هذا المقطع الثاني من الـ MAV المهادي والجسري، وإضافته إلى المقطع الأول من الـ MAV القشري الذي تم تشريحه إذا كان سيتم تحليلهما بشكل منفصل. بعد ذلك، ولمقارنة ملفات التعبير الجيني بين المخطط والقشرة الجدارية ومناطق الـ MAV في ظل الظروف الضابطة، يمكن إجراء تحليل التعبير الجيني باستخدام مصفوفات Agilent 0 1 4 8 7 9 لـ whole rat genome، المكونة من 4 × 44,060 mer oligonucleotide arrays. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول المعالجة والمسح والتخزين الأولي للبيانات في Thomas et al.

عند تنفيذ عملية التشريح بشكل صحيح، يجب أن تكون أنسجة MAV الناتجة عبارة عن كيانين سليمين يزن إجماليهما حوالي 35 إلى 45 ملليغرام. ويجب أن يزن جزء MAV الذي تم تشريحه أولاً ويحيط بمعظم القشرة حوالي 25 ملليغرام، بينما يزن الجزء الذي يغطي المهاد والجسور والقشرة القذالية حوالي 15 ملليغرام.

يجب أن يكون لون النسيج وردياً قليلاً نتيجة الدم المتبقي في الأوعية الدموية. يجب أن تكون الضفيرة المشيمية الثنائية التي تم حصادها في عينتين نسيجيتين سليمتين، تزن كل منهما من 1 إلى 2 mg كما هو موضح هنا. نرى هنا مقارنة لملفات التعبير الجيني في الجسم المخطط والقشرة الجدارية و MAV تحت ظروف التحكم.

يوضح المخطط العلوي التعبير في الجسم المخطط مقارنة بالقشرة الجدارية. وبينما يوضح المخطط السفلي التعبير في MAV مقارنة بالقشرة الجدارية، يمكن ملاحظة أن الجسم المخطط والقشرة الجدارية أكثر ارتباطاً ببعضهما البعض بكثير من MAV. نرى هنا التعبير الجيني التفاضلي في MAV استجابةً لفرط الحرارة مقارنة بالمجموعة الضابطة، واستجابةً للأمفيتامين مقارنة بالمجموعة الضابطة، وفي حالة فرط الحرارة مقابل الأمفيتامين.

أخيرًا، نرى هنا الجينات التي أظهرت تعبيرًا يزيد عن 15 ضعفًا في MAV مقارنةً بالقشرة الجدارية والمخطط، مصنفةً حسب الوظيفة. ترتبط العديد من هذه الجينات بالجهاز الوعائي و/أو الجهاز المناعي. أما الجينات الأخرى التي أظهرت تغيرات كبيرة جدًا في مستوى التعبير فهي بروتينات المصفوفة خارج الخلية، وناقلات solute، وأيض الدهون وحمض الريتينويك.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر التحلي بالصبر أثناء تشريح MAV. ومن المهم أيضاً أن يظل الدماغ مغموراً في محلول ملحي متساوي التوتر أو محلول ملحي منظم بالفوسفات طوال عملية التشريح. كما يُنصح بالتدرب على قطع MAV في أربعة أو خمسة من الجرذان قبل الحصول على الأنسجة المخصصة لإنتاج البيانات التجريبية.