في وقت واحد رسم المخ، في الوقت الحقيقي قياس تركيز اللاكتات والتلاعب Optogenetic من نشاط الخلايا العصبية في القشرة الدماغية القوارض

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس النوم المحدد عبر تخطيط كهربائية الدماغ (EEG) وتركيز اللاكتات أثناء التحفيز البصري الوراثي عند إحداثيات مجسمة دقيقة. يتم زرع أقطاب تخطيط كهربائية الدماغ والقنيات اللازمة لمستشعر اللاكتات وكابل الألياف الضوئية جراحيًا. بعد ذلك، يتم إدخال كابل الألياف الضوئية ومستشعر اللاكتات الذي تمت معايرته مسبقًا في القنيات الموجهة الخاصة بهما في جمجمة الحيوان.

بعد ذلك، قم بضبط شدة تحفيز الضوء الأزرق لتحقيق الاستجابة الفيزيولوجية الكهربائية المطلوبة. ثم انتقل إلى جمع بيانات تخطيط كهربائية الدماغ، وتخطيط كهربائية العضلات، وتركيز اللاكتات بينما يُترك الحيوان ليتصرف أو ينام بشكل طبيعي. وبالمقارنة مع الطرق الأخرى مثل الدراسات الفارماكولوجية لتخطيط كهربائية الدماغ (EEG)، يتميز هذا النهج التجريبي بميزة مراقبة الكيمياء الحيوية والفيزيولوجيا الكهربائية للدماغ بينما يتم التحكم في نشاط العصبونات في الوقت الفعلي على مقياس زمني يقل عن الثانية.

لذا، فإن إمكانية تقديم رؤى جديدة في مجال أبحاث النوم مرتفعة للغاية. فعلى سبيل المثال، يمكن للمرء تحديد المصاحبات الأيضية والكهروفسيولوجية لنوم الموجات البطيئة. كما يمكن تطبيق هذا النوع من التجارب في مجالات أخرى من العلوم العصبية، مثل التعلم والذاكرة، أو اللدونة المشبكية، أو اضطرابات النوبات الصرعية.

تُعد هذه التقنية الجراحية صعبة من الناحية التقنية، فهي تتطلب قدراً كبيراً من المهارة اليدوية، وهو أمر يمكن تحقيقه من خلال الممارسة. وفي هذا العرض المرئي، سأقوم بتكرار الخطوات الحرجة لبعض الإجراءات الجراحية المعقدة التي ستكمل الوصف المكتوب.

بمجرد تعافي الحيوان من الجراحة، يكمن التحدي في إدخال مستشعر اللاكتات وكابل الألياف الضوئية بشكل صحيح. سأقوم أنا وجوناثان بتوضيح كيفية استخدام قبضة محكمة عند تثبيت الحيوان لإدخال هاتين القطعتين الرقيقتين من المعدات. وأخيراً، سنوضح كيفية تحسين استجابة EEG من خلال ضبط شدة التحفيز في الوقت الفعلي.

في هذه التجربة، استخدم فئرانًا معدلة وراثيًا تعبر عن قناة كاتيونية حساسة للضوء الأزرق. تتبنى القناة في الخلايا العصبية القشرية الدماغية. أولاً، قم بتخدير الفأر باستخدام 5% isof fluorine و95% oxygen للتحريض، مع الحفاظ على التخدير باستخدام 3% isof fluorine و97% oxygen.

أجرِ شقاً وسطياً في الجزء العلوي من الجمجمة من المنطقة الواقعة بين العينين وصولاً إلى مؤخرة الجمجمة. نظف الجمجمة باستخدام بيروكسيد الهيدروجين والمحلول الملحي المعقم. حدد وعلم نقطتي B وLambda لتحديد الإحداثيات المجسمة لتهيئات التحفيز البصري الوراثي للأقطاب الكهربائية، ثم جهز ثقوب البراغي باستخدام مثقاب أسنان عالي السرعة مع لقمة كروية بقطر 0.5 millimeter، تليها لقمة كروية بقطر 0.7 millimeter.

أدخل براغي تثبيت القطب الكهربائي في الثقوب باستخدام مفك براغي يدوي مشقوق. قم بتدويرها من أربع إلى خمس دورات تقريبًا للوصول إلى العمق المطلوب. ثبت الكانيولات الموجهة في مكانها باستخدام كانيولا مجسمة، ثم قم بتثبيتها في الجمجمة والمرتكزات باستخدام الأسمنت الأكريليكي. وللحفاظ على النفاذية، يجب أن تحتوي كل كانيولا موجهة على كانيولا وهمية أو سلك توجيه (stylet) منذ وقت الجراحة وحتى وقت التجربة.

بمجرد وضع أقطاب تخطيط كهربية الدماغ (EEGs) والقنيات الموجهة في الجمجمة، يتم تثبيتها معاً بطبقة رقيقة من أسمنت الأكريليك السني. وبعد تصلب الأسمنت، ضع الموصل البلاستيكي فوق كومة الأسمنت الجافة، ثم قم بلحم نهايات الأسلاك الخارجة من أقطاب تخطيط كهربية الدماغ بنقاط التلامس الموجودة على الموصل البلاستيكي في حال غمر الأسلاك في الأسمنت. بعد ذلك، يتم سحب أسلاك تخطيط كهربية العضلات عبر العضلات النواتية عن طريق تمريرها داخل إبرة قياس 21 gauge.

قم بثقب العضلة واربط عقدة جراحية مزدوجة باستخدام خيط نايلون 5-0 حول هذه الأسلاك في نقطة تلي خروجها من العضلة مباشرة. قم بخياطة الجلد الذي تم إزاحته للوصول إلى أنسجة العضلة معاً باستخدام عقد جراحية منفردة ومتقطعة، وذلك بواسطة إبرة P3 ذات قطع عكسي وخيط نايلون 5-0. بمجرد برمجة وحدة تحفيز mc، قم بتشغيلها كمولد إشارات مستقل على شكل إشارة ثنائية (on-off) بجهد 5 volt. قم بتوصيل وحدة تحفيز mc بوحدة طاقة الليزر المفعلة بتقنية TTL باستخدام موصلات BNC.

قم بتوصيل وحدة طاقة الليزر بالليزر عبر كابل شريطي. وقم أيضاً بتوصيل الليزر بموصل FC الذكر الموجود في كابل التوصيل الليفي البصري المصدر. ثم قم بتوصيل الكابل الليفي البصري المصدر بالوصلة الدوارة.

يعمل الموصل الدوار للألياف الضوئية كـ commutator. وبينما يتحرك الحيوان داخل القفص، يدور الوصل الدوار لمنع تكسر كابلات الألياف الضوئية الناتج عن عزم الدوران. وباستخدام أربطة كابلات بلاستيكية، قم بتثبيت الموصل الدوار على حامل معدني موضوع فوق القفص الأسطواني الذي يوجد بداخله الحيوان.

قم بتثبيت الفأر باستخدام يد واحدة عبر ضغط الفأر تحت راحة اليد المقوسة. وجه الرأس بحيث يكون بين إصبعي الوسطى والسبابة للمجرب. الآن، قم بتنظيف القنية الموجهة من العوالق باستخدام إبرة معقمة بقياس 25 gauge.

بعد ذلك، قم بإدخال كابل الألياف الضوئية يدويًا وثبته في كانيولا توجيه الألياف الضوئية باستخدام غطاء لولبي. تحكم في عمق إدخال كابل الألياف الضوئية في الدماغ بواسطة عقدة خياطة مربوطة على كابل الألياف الضوئية على مسافة ثابتة من الطرف المسطح المقطوع. يتم معايرة المستشعر في محلول ملحي منظم بالفوسفات وتعريضه لثلاث تركيزات من L lactate بطريقة تدريجية.

وفقاً لبروتوكولات الشركة المصنعة، أدخل المستشعر الذي تمت معايرته مسبقاً في كانيولا توجيه اللاكتات المثبتة في الجمجمة بطريقة مطابقة لإجراء إدخال كابل الألياف الضوئية. قم بتوصيل مستشعر اللاكتات بالمضخم الأولي لجهاز pinnacle 8, 400 biosensor باستخدام موصلات قابس ثنائية القطب. ثم قم بتوصيل هذا المضخم الأولي بالموصل ذو الثماني دبابيس الموجود في وحدة التثبيت الرأسية المزروعة جراحياً.

قبل البدء في جمع البيانات، استخدم مقبض التحكم في شدة الليزر لضبط شدة التحفيز البصري الوراثي. ستتفاوت سعة استجابة تخطيط كهربائية الدماغ (EEG) بين الحيوانات نتيجة لعوامل لم يتم دراستها بشكل منهجي؛ لذا، من الضروري ضبط شدة التحفيز البصري الوراثي والتحقق من أن استجابة تخطيط كهربائية الدماغ (EEG) كافية عند الوصول إلى الاستجابة المطلوبة.

قم بجمع البيانات باستخدام نظام Pinnacle 8, 400 مع تطبيق neuro score. وتصنف واجهة SEIA حالات النوم عن طريق الفحص البصري لبيانات تخطيط كهربائية الدماغ (EEG) وتخطيط كهربائية العضلات (EMG). يتم تقسيم البيانات إلى حقب زمنية مدتها عشر ثوانٍ وتصنيفها كحالة يقظة، أو نوم غير سريع حركة العين، أو نوم سريع حركة العين بناءً على بيانات EEG و EMG.

يوضح تكوين تحفيز البصريات الوراثية في هذا المستشعر الحيوي أقطاب تخطيط كهربائية الدماغ (EEG) المزروعة جراحيًا، ومستشعر اللاكتات، والكانولا المستخدمة للتحفيز البصري الوراثي. وفي غياب التحفيز البصري الوراثي، خضع هذا الفأر لنوم تلقائي. كما تم رصد انتقالات حالة اليقظة أثناء المراقبة المستمرة لـ E-E-G-E-M-G وتركيز اللاكتات الدماغي في حالتي اليقظة ونوعي النوم.

يتم تحديد مرحلتي حركة العين السريعة وحركة العين غير السريعة بناءً على تخطيط كهربائية الدماغ (EEG) وتخطيط كهربائية العضلات (EMG). ومن المثير للاهتمام أن تيار المستشعر الحيوي للاكتات يرتفع كدالة لموجات EEG ذات السعة المنخفضة، وينخفض كدالة لموجات EEG ذات السعة العالية. وتستجيب كلتا قناتي EEG للمنبهات البصرية الوراثية التي يتم تقديمها في القشرة الجبهية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء عملية زرع جراحية للفأر من أجل التلاعب البصري الوراثي المتزامن وقياس تخطيط كهربائية الدماغ، وتخطيط كهربائية العضلات، وتركيز اللاكتات في الدماغ. بمجرد إتقان هذه التقنية الجراحية، يمكن تنفيذها بشكل صحيح في غضون 90 إلى 120 دقيقة. تذكر مراقبة تنفس الحيوان باستمرار كمقياس لعمق التخدير.

إذا كان تنفس الحيوان بمعدل أقل من مرة كل أربع إلى خمس ثوانٍ، فقد يكون التخدير عميقاً جداً. أما إذا كان تنفس الحيوان بمعدل أكثر من مرة كل ثانيتين، فقد يكون التخدير خفيفاً جداً. تذكر اتخاذ احتياطات السلامة المناسبة عند استخدام عامل التخدير الغازي isof fluorine.

تأكد من وجود تهوية كافية في جناح الجراحة لحماية شبكية العين من الليزر المستخدم في التحفيز البصري الوراثي. ارتدِ نظارات واقية أو ضع الحيوان داخل خزانة عازلة للضوء. يُنصح بالتدرب على زرع المستشعر الحيوي للاكتات وكابل الألياف الضوئية في فأر مستيقظ تماماً.

لا تستجيب الفئران لهذه الإجراءات، لذا يجب تثبيتها. ومع ذلك، يجب ألا يكون التثبيت قوياً لدرجة تؤدي إلى إصابة الحيوان أو إعاقة التنفس.