العزلة، وتوصيف المقارن التمييز بين الخلايا الجذعية البشرية الأسنان اللب المستمدة من الأسنان الدائمة باستخدام طريقتين مختلفتين

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل وتوصيف وتمييز الخلايا الجذعية اللبية البشرية من الأسنان الدائمة باستخدام طريقتين. ويتم تحقيق ذلك عن طريق جمع أضراس العقل المنطمرة السليمة، وقطعها حول منطقة الاتصال بين الملاط والميناء في البداية. يتم عزل الخلايا الجذعية السنية اللبية D PSCs بطريقتين مختلفتين.

في الطريقة الأولى، يتم هضم أنسجة السلائل إنزيميًا عن طريق التحضين في محلول الكولاجيناز من النوع الأول بالإضافة إلى محلول المسافة القرصية. ونشير إليها هنا بـ ed. وبالنظر إلى طريقة العزل في الطريقة الثانية، يتم وضع أنسجة اللمس في الدورق مباشرة دون إجراء أي عملية هضم.

وبهذه الطريقة، تبدأ الخلايا الجذعية المشتقة من السن (dpss) في الهجرة من النسيج إلى القارورة. وتُسمى هذه الخلايا OG نسبةً إلى طريقة العزل عن طريق النمو الخارجي (outgrowth isolation method). وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تحديد الخلايا الجذعية باستخدام قياس التدفق الخلوي (flow cytometry).

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في تحفيز تمايز الخلايا المكونة للعاج، بينما تتمثل الخطوة النهائية في التقييم المقارن لتمايز الخلايا المكونة للعاج بين مجموعتين عن طريق صبغ Alizarin Red و QBCR. أنا RA Kde من قسم الخلايا الجذعية والبيولوجيا التنموية في معهد Rian. سأعرض لكم اليوم كيفية عزل وتوصيف والتمايز المقارن للخلايا الجذعية الميزنكيمية البشرية باستخدام طريقتين.

مرحباً، أنا الدكتور ريزايان من معهد ريو. نحن نعمل على مشروع متعلق بالخلايا الجذعية لللب السني البشري. هذه الخلايا هي نوع من الخلايا الجذعية الميزنكيمية، والتي يسهل الحصول عليها بأقل قدر من الألم والمضاعفات.

تتميز الخلايا الجذعية النخاعية بقدرة عالية على التجدد البلاستيكي، وتكوين المستعمرات، والقدرة على التمايز المتعدد. مرحباً، أنا الدكتورة أمي من قسم الخلايا الجذعية. نستخدم في المعهد هذا الإجراء في مختبرنا لعزل الخلايا الجذعية لغرض الدراسات البحثية والتطبيقات المستقبلية.

في الطب التجديدي، تتمثل الخطوة الأولى لاستخدام هذا المصدر من الخلايا الجذعية في العلاجات المستقبلية القائمة على الخلايا الجذعية في اختيار البروتوكول الأمثل لعزل الخلايا الجذعية من أنسجة جزء بشري. ولتحقيق هذا الهدف، من الضروري استقصاء جوانب معينة من السلوك الخلوي تحت ظروف عزل مختلفة للخلايا الجذعية. أولاً، سأقوم بعزل الخلايا الجذعية من لب الأسنان البشري باستخدام إما التفكك الإنزيمي للب اللب أو نمو الخلايا الجذعية من غرسات الأنسجة.

بعد ذلك، يتم توصيفها وتمييزها إلى انفجارات أوجين. لذا، لنبدأ. أولاً، يتم إذابة كل من مادة space وكولاجيناز Type one في محلول PBS.

ثم قم بترشيحها باستخدام مرشح سرنجة بمسامية 0.2 micron. اسحب كلاهما إلى أنبوب مخروطي. ثم أضف pener وPBS للوصول إلى التركيز النهائي.

انقل أضراس العقل السليمة إلى المختبر في وسط أساسي بارد تحت ظروف معقمة. نظف سطح السن باستخدام ethanol بتركيز 70% قبل البدء بالدراسة. تأكد من إزالة كافة الشوائب من على سطح السن.

اقطع السن حول منطقة اتصال الميناء بالملاط باستخدام قرص أسنان معقم للكشف عن حجرة اللب. يجب مراعاة تنفيذ عملية القطع ببطء لتقليل ارتفاع درجة حرارة أنسجة السن. بعد ذلك، افصل أنسجة اللب برفق عن التاج، بحيث يتم تقطيع أنسجة اللب إلى قطع يتراوح حجمها بين واحد إلى اثنين مليمتر باستخدام شفرة Scarpa.

انقل قطعاً صغيرة من أنسجة اللب إلى 1 mL من المحلول الإنزيمي لمدة ساعة واحدة عند 37 °C، مع استخدام جهاز الرج (vortex) كل 30 دقيقة للمساعدة في تفتيت أنسجة اللب. بعد ذلك، قم بإزالة التجمعات الكبيرة بتمريرها عبر مصفاة خلايا بمسامية 70 micron. ثم أضف PBS المحتوي على PENER واطرد العينات بجهاز الطرد المركزي بسرعة 1,200 RPM لمدة خمس دقائق.

قم بإزالة السائل الطافي بعناية. بعد ذلك، نقوم بتعليق الطبق في وسط التكاثر pm وننقله إلى دورق الزرع ونضيف الوسط. ثم يتم التحضين.

قم بتغيير الوسط الغذائي كل ثلاثة أيام حتى يتم الوصول إلى درجة الالتحام الخلوي المطلوبة لطريقة العمل الخارجي. كرر عملية التقطيع. ويُقصد بتقطيع السن تحويل الأنسجة إلى قطع يتراوح حجمها بين واحد إلى اثنين مليمتر.

بعد ذلك، ضعها في المزرعة. أضف وسط التكاثر ثم قم بالتحضين. يجب مراعاة أن الحجم الإجمالي لوسط التكاثر يجب أن يكون كافياً لدعم التصاق جميع القطع لضمان نمو الخلايا لاحقاً.

قم بتغيير الوسط الغذائي بعد ملاحظة النمو الخارجي، ثم كل ثلاثة أيام حتى يتم تحقيق الاندماج الخلوي. وبالنسبة للتنميط المناعي، يتم تحضين كلا النوعين من D PSCs مع أجسام مضادة مقترنة بـ PE أو FITC لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة أربعة °C في الظلام. ثم أضف PBS وقم بالطرد المركزي بسرعة 1,200 RPM لمدة خمس دقائق.

قم بإزالة الطافي، ثم أعد تعليق الخلايا في محلول PBS، وفي النهاية قم بتقييم العلامات السطحية باستخدام مقياس تدفق الخلايا (flow cytometer). قم باستزراع كل نوع من الخلايا الجذعية السنية (DPCs) لثلاث ممرات. بعد ذلك، استخدم التريبسين والثلج وانقلها إلى ستة أطباق زراعة حمراء بكثافة 60%، واستبدل وسط PM بالوسط السني (odontogenic medium). تُترك ثلاث آبار كضابط سلبي عن طريق إضافة pm.

غيّر الوسط كل ثلاثة أيام، وفي اليوم الحادي والعشرين اغسل الخلايا باستخدام PBS. ثم قم بتثبيتها بإضافة 10% formal gel height بمقدار 1 مل لكل بئر لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد مرور 15 دقيقة، يتم إزالة المثبت بعناية وغسل الخلايا ثلاث مرات بالماء المقطر. بعد ذلك، يُستبدل الماء بـ 1 mL من محلول صبغة alza الحمراء. وبعد 20 دقيقة، تتم إزالة الصبغة الزائدة وغسل الخلايا أربع مرات بالماء منزوع الأيونات.

ثم أضف 1 mm من الماء لكل بئر لمنع جفاف الخلايا. بعد التلوين، يمكنك ملاحظة تحول ثلاثة قضبان علوية إلى اللون الأحمر مقارنة بمجموعات الضبط تحت المجهر، ويمكنك رؤية امتصاص لون الصبغة حول الخلية باستخدام تكبير عالٍ لتقدير كمية التلوين الأحمر. بعد إزالة الماء، أضف 1 mL من حمض الأسيتيك بتركيز 10% لكل بئر، ثم حضنها لمدة 30 دقيقة مع الرج.

بعد ذلك، قم بكشط الخلايا برفق من الطبق باستخدام كاشطة الخلايا. ثم انقلها إلى أنابيب منفصلة. يتم الرج (VOR) بقوة لمدة 30 ثانية.

ثم يتم تسخينها إلى 85 °C لمدة 10 دقائق. ولتجنب التبخر، تُسد الأنابيب باستخدام ParaView ثم تُنقل إلى الثلج لمدة خمس دقائق، وبعد ذلك تُطرد مركزياً عند 20,000 G لمدة 15 دقيقة. وفي هذه الأثناء، يتم تحضير تخفيف تسلسلي قياسي لصبغة Alizarin red وفقاً لبروتوكول الكاشف.

بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة الطافي وانقله إلى أنابيب جديدة. قم بمعادلة الرقم الهيدروجيني باستخدام هيدروكسيد الأمونيوم بتركيز 10%. بعد ذلك، أضف المعايير والعينات إلى صفيحة 96.

ضع العينات في طبق الآبار ثم قم بقياس الامتصاصية عند 405 nanometer وحلل البيانات وفقاً للتخفيف التسلسلي القياسي. يمكنك هنا رؤية DPCs، التي تم عزلها عن طريق التفكيك الإنزيمي في الأيام العاشر والخامس عشر والثامن عشر، وكذلك outgrown DPCs في الأيام الخامس والعاشر والثالث عشر والثامن عشر. كلا النوعين من dpss في sase three متماثلان تقريباً في الحجم والمورفولوجيا. وتظهر نتائج التنميط المناعي وجود علامات الخلايا الجذعية الميزنكيمية مثل CD 44 و CD 73 و CD 19، وغياب العلامات المكونة للدم والبطانية مثل CD 34 و CD 45 و CD 11 B. ومن المثير للاهتمام أن تعبيرات CD 1 0 5 و CD 146 كانت أعلى في outgrown d PSCs مقارنة بـ D-P-S-C-E-D، كما أظهر التحديد الكمي لصبغة enzyme red في اليوم الحادي والعشرين من تمايز odontoblast ترسباً أكبر للكالسيوم في D-P-S-C-E-D مقارنة بـ without con dental top of stem cells.

تشير نتائج qPCR أيضاً إلى تعبيرات أعلى بكثير لكل من MEP و A LP كعلامات تمعدن في D-P-S-C-D مقارنة بالخلايا الجذنية السنية الخارجة. وفي الوقت ذاته، يتم تنظيم كلا الجينين أثناء التمايز، كما زاد تعبير DSPP كعلامة تكون السن أثناء عملية التمايز. ومع ذلك، لا يوجد تفاوت ملحوظ في تعبير DSVP في الخلايا المتمايزة بين مجموعتي ED و OG.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية عزل الخلايا الجذعية لِلُب الأسنان البشرية باستخدام إما التفكيك الإنزيمي للُب أو نمو الخلايا الجذعية من قطعة نسيجية مستأصلة. هذا كل شيء، وأتمنى لكم كل التوفيق في تطبيق هذا الإجراء في تجاربكم.

شكراً لك.