تحليل الانصهار الغشاء بوساطة كمين باستخدام الانصهار خلية الفحص الانزيمي

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس أحداث اندماج الخلايا التي تتوسطها بروتينات snare كمياً من خلال التعبير المنشط لـ beta galacto. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق التعبير عن بروتينات v و t snare بشكل خارجي على سطح خلايا cost seven. وتتمثل الخطوة التالية من الإجراء في دمج الخلايا التي تعبر عن بروتينات V snare مع الخلايا التي تعبر عن بروتينات T snare.

يؤدي هذا إلى اندماج الخلايا بوساطة بروتينات SNARE والتعبير المنشط لإنزيم بيتا-جالاكتوزيداز. وفي النهاية، يتم قياس نشاط بيتا-جالاكتوزيداز الناتج عن اندماج الخلايا باستخدام جهاز المطياف الضوئي. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية، مقارنة بالطرق الحالية مثل مقايسة منطقة SAL المجهرية، في قدرتها على تحليل تركيبات متعددة من بروتينات SNARE.

من الناحية الكمية، على الرغم من إمكانية تطبيق هذه الطريقة لفهم آلية وتنظيم اندماج الغشاء بوساطة بروتينات snare، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً لإجراء دراسات عالية الإنتاجية. سيقوم د. نـا حسن، باحث ما بعد الدكتوراه، وديفيد همفري، فني من مختبري، بشرح الإجراء في اليوم السابق لتحميل عملية عفن التحول (transfection).

أطباق ذات 24 بئرًا مع شرائح غطاء زجاجية بقطر 12 ملم؛ قم بتجهيز بئرين لكل مجموعة من الخلايا التي تعبر عن بلازميدات فريدة في التجربة على هذه الشرائح. ازرع 30,000 من خلايا cost seven المستزرعة في وسط DMEM مضاف إليه 4.5 g/L من الجلوكوز و 10% FBS من أجل عملية التعداء (transfection). أضف إلى كل بئر من خلايا V ربع ميكروجرام من بلازميد TTA ومجموعة واحدة من بلازميدات التعبير.

استخدم البروتينات المستهدفة المقلوبة، والتي كانت في هذه الحالة vamps، لنقل الجينات إلى الخلايا التائية (T cells) من خلال إضافة ربع ميكروجرام من البلازميد الذي يشفر TRE lacks Z، ومجموعة البلازميدات المكملة التي تشفر البروتينات المستهدفة المقلوبة؛ وفي هذه الحالة كانت snap 25 وsyntaxin one وsyntaxin four. الآن، قم بنقل الجينات إلى cost seven باستخدام lipectomy وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، وزرع الخلايا لمدة 24 ساعة. وبعد 24 ساعة من عملية نقل الجينات، قم بتثبيت الخلايا في para formaldehyde المضاف إليه المكملات لمدة 10 دقائق، وبعد التثبيت، اشطف الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS++، ثم قم بحجب الخلايا باستخدام FBS المضاف إليه المكملات لمدة 30 دقيقة.

بعد عملية الحجب، يتم تحضين الخلايا مع الجسم المضاد أحادي النسيلة anti mic Nine E 10 لمدة 30 دقيقة. بعد أربع غسلات بـ PBS++، يتم تحضين الخلايا لمدة ساعة مع أجسام مضادة ثانوية مقترنة بـ fitzy بتخفيف 1:500. وبعد أربع غسلات أخرى بـ PBS++، يتم تثبيت الخلايا الملحقة في كاشف anti fade متوفر تجاريًا.

أصبحت الخلايا الآن جاهزة للمجهر البؤري (confocal microscopy)؛ ففي اليوم الذي يسبق عملية عفن الخلايا (transfection)، يتم استزراع 1.2 مليون خلية Cos-7 في كل طبق زراعة أنسجة بمقاس 100 مليمتر، و200,000 خلية Cos-7 في كل بئر من أطباق الستة آبار لكل تركيبة بلازميد سيتم تحليلها. يتم تحضير بئر واحد، وتُستزرع الخلايا لمدة 24 ساعة. وفي اليوم التالي، تُضاف البلازميدات لعملية عفن الخلايا؛ بالنسبة لخلايا V، يتم عفن بلازميد يعبر عن بروتين FLIP المراد دراسته و 5 µg من pTet-Off في الخلايا الموجودة في كل مزرعة بمقاس 100 مليمتر.

قم بنقل الخلايا الضابطة (control cells) إلى طبق زراعة بقطر 100 مليمتر، ثم قم بنقل ناقل فارغ وP te off إليها بنفس التركيزات النسبية المستخدمة في الخلايا V. بعد إضافة جميع البلازميدات إلى الخلايا V والخلايا الضابطة، أضف tcom mycin إلى تلك الآبار لمنع عملية N glycosylation لبروتينات vamps. في كل بئر من أطباق الستة آبار، قم بنقل الخلايا T باستخدام 1 ميكروجرام من PBIG مع البلازميدات المكملة التي تعبر عن البروتينات المستهدفة.

الآن، قم بنقل الجينات إلى خلايا cost seven باستخدام lip وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك، قم باستزراع الخلايا لمدة 24 ساعة، وبعد مرور 24 ساعة على عملية نقل الجينات، قم بفصل خلايا V من أطباق الاستزراع باستخدام محلول تفكيك الخلايا الخالي من الإنزيمات. ابدأ بغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 20 milliliters من PBS.

ثم أضف 5 mL من محلول تفكيك خالٍ من الإنزيمات. بعد فترة حضانة مدتها 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ستنفصل الخلايا عن طريق النقر بقوة على الطبق؛ تحقق من انفصالها تحت المجهر. إذا انفصلت أقل من نصف الخلايا، انتظر خمس دقائق أخرى ثم انقر على الطبق مرة ثانية.

استمر في الحضن في محلول الفصل حتى تنفصل أكثر من نصف الخلايا. ثم قم بعد خلايا V باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer). بعد ذلك، قم بإعادة تعليق خلايا V بتركيز يقارب 480,000 خلية لكل milliliter في محلول DMEM المكمل.

أضف الآن 1 mL من خلايا V المعلقة إلى كل بئر يحتوي على خلايا T، ثم أعد الأطباق إلى الحاضنة. بعد ست أو 12 أو 24 ساعة من الزراعة المشتركة للخلايا، اغسلها باستخدام PBS وأضف محلول التحلل (lysis buffer). بعد ذلك، قم بكشط الخلايا من الآبار وانقلها إلى أنابيب من أجل عملية الطرد المركزي.

بعد عملية الطرد المركزي، انقل الطافي إلى أنبوب جديد وقس تعبير beta galacto باستخدام مقايسة متاحة تجارياً وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة؛ خلال هذا البروتوكول، تأكد من إيقاف تفاعل cholera metric بعد 90 دقيقة بإضافة كربونات الصوديوم بتركيز one molar لتقييم النتائج. قس الامتصاصية عند 420 nanometers باستخدام جهاز spectrophotometer. عندما تم ترانسفكشن خلايا CO seven ببلازميدات flipped snare، تم تعبير بروتينات flipped snare على سطح الخلية.

استُخدم قياس التدفق الخلوي (Flow cytometry) لقياس مستويات تعبير بروتينات snare على سطح الخلية. ومن أجل مقارنة قدراتها على دمج الغشاء، كان من الضروري التعبير عن بروتينات vamps بنفس المستوى. وبناءً على ذلك، تم معايرة تركيز كل بلازميد snare مقلوب مستخدم في عملية عفن الخلية (transfection) وتحسينه من أجل هذه العملية.

تحت هذه الظروف، تم التعبير عن vamps 1 و3 و4 و5 و7 و8، وsyntaxin 1 و4 بنفس المستوى على سطح الخلية على التوالي، وقد استُخدمت بروتينات snares العصبونية التي تتوسط عملية الإخراج الخلوي التشابكي لاختبار جدوى المقايسة. وبالفعل، عند دمج خلايا V التي تعبر عن vamp 2 وخلايا T التي تعبر عن SYNTAXIN 1 وsnap 25، تم الكشف عن تعبير قوي لـ beta galacto. ومع ذلك، عندما لم يتم التعبير عن vamp 2 أو SNAP 25، تم الكشف فقط عن نشاط أساسي لـ beta galacto sase، مما يشير إلى أن اندماج الخلايا والتعبير عن beta galacto sase يعتمدان على التفاعلات بين v وt snares؛ وبشكل عام، أظهر كل من SYNTAXIN 1 وsnap 25 وvamp 1 وvamp 3 وvamp 8 أنشطة اندماج متقاربة وكانت هي الأعلى.

وفي المقابل، يشير نشاط beta GAL الأساسي إلى أن المزيج البروتيني لا يحفز اندماج الغشاء، كما هو الحال بين vamp five و SYNTAXIN one و Snap 25. وأثناء إجراء مقايسة الاندماج الإنزيمي، من المهم تذكر إضافة unica mycin لمنع عملية الـ an glycosylation لبروتينات esna، وإضافة DTT لمنع تكوين روابط ثنائي الكبريتيد بين بروتينات esna.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية إجراء مقايسة دمج الخلايا.