إعداد خطوط الخليوي لضربة قاضية شرطي في التعبير الجيني وقياس تأثيرات ضربة قاضية على الموت الناتج عن خلية E4orf4

الهدف العام من التجربة التالية هو مراقبة تأثير تثبيط ACF1 أو SNF2H على موت الخلايا المستحث بواسطة E4 أو F4. ويتم تحقيق ذلك من خلال إنشاء خطوط خلوية يتم فيها تنشيط تعبير srna لـ ACF1 أو SNF2H بشكل مشروط عن طريق إضافة الدوكسيسيكلين، مما يؤدي في خطوة ثانية إلى خفض مستويات بروتين ACF1 أو SNF2H. ثم تُعالج خلايا الخطوط الخلوية التي تم الحصول عليها بالدوكسيسيكلين لتقليل تعبير ACF1 أو SNF2H، أو تُترك دون معالجة.

بعد ذلك، يتم التعبير عن E4orf4 في الخلايا مع أو بدون shRNA المقاوم لـ ACF1 أو SNF2H. ومن أجل استقصاء تأثير ACF1 أو SNF2H على موت الخلايا الناجم عن E4orf4، تم الحصول على نتائج توضح تأثير مستويات ACF1 أو SNF2H على سمية E4orf4 بناءً على عدّ النوى ذات المورفولوجيا الاستماتية باستخدام مقايسة JY. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الأخرى، مثل ترانسفكشن RNA العابر، في أن جميع الخلايا تعبر عن shRNA وأن نسبة الخلايا التي تعبر معه بالتزامن مع البلازميد التقليدي تكون أعلى. توفر هذه الطريقة رؤية متعمقة في الآليات الكامنة وراء موت الخلايا الناجم عن E4orf4، كما يمكن تطبيقها أيضاً في دراسة البروتينات البروتيكية الأخرى.

بالإضافة إلى Ana Lafe، سيقوم باحث من مختبري بشرح أجزاء من هذا الإجراء. لبدء إجراء إنشاء خطوط خلوية قابلة للاستحثاث، يتم زرع خلايا T-Rex 2 9 3 بكثافة تبلغ حوالي 5×10⁶ خلية لكل طبق بمساحة 10 cm في 8 mL من وسط DMEM الذي يحتوي على المصل بدون tetracycline ومع 5 µg/mL من blaster aside، ثم تُحضن الأطباق طوال الليل عند 37 °C و5% CO₂. وفي اليوم التالي، يتم استبدال الوسط بـ 8 mL من وسط جديد قبل عملية عفن transfection. البلازميد المستخدم في الـ transfection هو بلازميد P superior neo plus GFP الذي يشفر ACF1 أو SNF2 H-S-H-R-N-A، ويتم توجيهه بواسطة h1 promoter قابل للاستحثاث بواسطة tetracycline، بالإضافة إلى جين مقاومة neomycin المدمج مع GFP والذي يتم توجيهه بواسطة PGK promoter تأسيسي.

أضف 10 µg من الحمض النووي البلازميدي (plasmid DNA) إلى 500 µL من كلوريد الصوديوم بتركيز 150 mM وقم بالرج باستخدام جهاز الفورتيكس (vortex). بعد ذلك، أضف كاشف jet PY بمعدل 2 µL لكل 1 µg من الحمض النووي إلى أنبوب آخر يحتوي على 500 µL من كلوريد الصوديوم بتركيز 150 mM وقم بالرج باستخدام الفورتيكس. أضف محلول jet pie إلى الحمض النووي واخلطه جيداً باستخدام جهاز الفورتيكس.

يُحضن المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. وبعد مرور 15 دقيقة، تُنقل معقدات DNA بعناية بواسطة الماصة إلى أطباق بقطر 10 سنتيمتر تحتوي على خلايا T-Rex 2 9 3 بنسبة تلاقي تتراوح بين 70 إلى 80% في اليوم التالي.

استبدل الوسط بوسط انتقائي، في هذا المثال DMEM كما سبق، يحتوي على 500 micrograms per milliliter من G418. ولمدة الأسبوعين التاليين، راقب الخلايا. استبدل الوسط الانتقائي بوسط جديد مماثل كل ثلاثة إلى أربعة أيام حتى تظهر المستعمرات.

حدد المستعمرات بالعين المجردة وضع علامة على موقعها في أسفل الطبق باستخدام قلم تحديد ملون. تحقق تحت المجهر من أن المستعمرات متباعدة جيدًا. يمكن عزل المستعمرات بمجرد أن تصبح كبيرة بما يكفي لرؤيتها دون الحاجة إلى مجهر.

لضمان نجاح هذا الإجراء، من المهم اختيار مستعمرات متباعدة جيداً أثناء عملية عزل المستعمرات. وفي غطاء معقم، قم بشفط الوسط من الطبق. ثم اشطفه بلطف باستخدام PBS واشفط جميع السوائل المتبقية جيداً.

أضف ثلاثة ميكرولتر من 0.25% tripsin في EDTA إلى مستعمرة واحدة على الطبق، مع تحريك الـ tripsin بشكل متكرر حتى تنفصل الخلايا عن الطبق. انقل الخلايا إلى وسط انتقائي في بئر ضمن طبق مكون من 24 بئراً. كرر هذه العملية لعدة مستعمرات أخرى على الطبق.

قم بتنمية الخلايا عند 37 °C و 5% carbon dioxide حتى تملأ البئر. بعد ذلك، قم بتجزئة الخلايا من كل مستعمرة أصلية إلى ثلاثة آبار في طبق منفصل يحتوي على 12 بئراً، واحضرها في الحاضنة طوال الليل في اليوم التالي. استبدل الوسط في أحد الأطباق بوسط يحتوي على 1 µg/mL من doxycycline من محلول مخزون تم تحضيره في ماء مقطر مرتين.

استبدل الوسط في طبق ضابط بوسط خالٍ من doxycycline. حضن الخلايا عند 37 °C و5% carbon dioxide لمدة 72 ساعة. ثم يتم حصاد الخلايا من بئر واحدة معالجة وبئر واحدة غير معالجة لتحليل western blot لتحديد كفاءة إسكات ACF one أو SNF two H؛ تظهر هنا نتيجة نموذجية.

تم صبغ هذه اللطخة بأجسام مضادة لـ SNF2H و alpha tubulin، حيث استُخدم الأخير كضابط تحميل. أظهر المستنسخان رقم 4 ورقم 5 انخفاضاً قوياً في SNF2H عند التحفيز بـ doxycycline، وبناءً على ذلك تم اختيارهما للاستخدام في تجربة التعطيل الجيني، والتي سيتم توضيحها في الجزء التالي.

ستُستخدم الخلايا غير المعالجة في الطبق الثالث لتكثير الخط الخلوي المختار، ومن ثم سيتم تجميد حصص من تلك الخلايا. وللاستخدام اللاحق في تحفيز تثبيط ACF1 أو SNF2H في خلايا الأطباق ذات الـ 10 سنتيمتر في وسط انتقائي، أضف doxycycline بتركيز 1 µg/mL إلى نصف الأطباق، ثم حضنها عند 37 °C و 5% CO2 لمدة تتراوح من 48 إلى 72 ساعة. يجب أن توفر كل مجموعة من الأطباق خلايا تكفي لـ 12 طبقاً بقطر 6 سنتيمتر، بما في ذلك مكرران لاختبار DPI لكل نقطة، بالإضافة إلى طبق واحد لتحليل western blot لكل عينة.

بعد مرور 48 إلى 72 ساعة من التحريض، يتم فصل الخلايا من كل مجموعة باستخدام التربسين، وبعد عدّها، يتم استزراع 1.5 × 10⁶ خلية في أطباق بقطر 6 سم في الوسط نفسه، سواء بوجود الدوكسيسيكلين أو بدونه. تُحضن الخلايا عند 37 °C و5% CO₂ طوال الليل، وفي اليوم التالي، يتم إجراء عملية ترانسفكشن للخلايا كما هو موضح.

يتم ترانسفكشن كل من الخلايا غير المعالجة والخلايا المعالجة بالدوكسيسيكلين في ثلاث مكررات بأربع طرق. الأولى باستخدام بلازميد فارغ وبلازميد يعبر عن GFP، والثانية باستخدام البلازميد الفارغ بالإضافة إلى ناقل يعبر عن SHRA resistant ACF one GFP أو SNF two HGFP، والثالثة باستخدام بلازميد يشفر E four، والرابعة باستخدام بلازميد يعبر عن GFP مع البلازميد الذي يشفر E four، بالإضافة إلى الناقل الذي يعبر عن SHRA resistant ACF one GFP أو SNF two HGFP. بعد عملية الترانسفكشن، يتم تحضين جميع الأطباق عند 37 °C و 5% carbon dioxide طوال الليل.

في اليوم التالي لعملية عفن الخلايا (transfection)، استخلص البروتينات من طبق واحد لكل عينة لإجراء تحليل لطخة ويسترن (Western blot) للتأكد من تثبيط تعبير ACF one أو SNF two H بكفاءة، ومن تعبير E four or four بشكل متساوٍ في العينات المختلفة. سيتم استخدام الأطباق الـ 16 المتبقية في مقايسة DPI. اشفط الوسط من الأطباق المخصصة لمقايسة DPI واغسل الخلايا برفق باستخدام PBS داخل غطاء كيميائي.

أضف 1 mL من البارافورمالدهيد بتركيز 4% المُحضّر في PBS لتغطية الخلايا، ثم قم بالتحضين لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة دون رج. اسحب البارافورمالدهيد واغسل الخلايا باستخدام PBS مع الرج في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. كرر عملية الغسل مرتين إضافيتين ليصبح المجموع ثلاث غسلات، وبعد الغسلة الثالثة بـ PBS، أضف Ethanol بتركيز 80% المحفوظ في درجة حرارة -20 °C، وقم بالتحضين في درجة حرارة -20 °C لمدة ساعة واحدة على الأقل.

قم بشفط الإيثانول واغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS مع الرج في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق في كل مرة، وبعد ذلك اغسلها مرة واحدة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة باستخدام PBS يحتوي على 0.5%BSA و0.05%Tween 20 أو P-B-S-B-T، مع الرج أيضاً لمنع الارتباط غير النوعي للأجسام المضادة. قم بحجب الخلايا في واحد ملليلتر من محلول P-B-S-B-T المنظم الذي يحتوي على 10% goat serum لمدة 20 دقيقة مع الرج في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، اغسل الخلايا مرتين باستخدام P-B-S-B-T لمدة خمس دقائق لكل غسلة. حضّن الخلايا مع الجسم المضاد الأولي، وهو في هذه الحالة جسم مضاد محدد لـ E four أو four، في 1 mL من P-B-S-B-T لمدة ساعة واحدة مع الرج في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل مرتين باستخدام P-B-S-B-T ومرة واحدة باستخدام PBS يحتوي على 0.1% BSA لمدة خمس دقائق لكل غسلة.

بعد ذلك، أضف إلى الخلايا 1 mL من PBS 0.1%BSA الذي يحتوي على الجسم المضاد الثانوي المناسب المسمى فلوريًا وبتركيز 0.5 µg/mL من DPI، ثم قم بالتحضين لمدة 40 دقيقة مع الرج في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام. وأخيرًا، اغسل باستخدام PBS لمدة خمس دقائق.

جفف البئر عن طريق الشفط واترك الأطباق مقلوبة لمدة ساعة إضافية أو طوال الليل لضمان التجفيف التام، ثم غطها برقائق الألومنيوم وثبت شرائح التغطية فوق الخلايا باستخدام محلول flora Mount G. احفظ الأطباق في درجة حرارة 4 °C في الظلام حتى يحين وقت العد. تم تثبيت الخلايا ذات النوى المبرمج موتها والتي خضعت للمعاملات المختلفة الموصوفة في البروتوكول، ثم صُبغت باستخدام أجسام مضادة محددة لـ E4 أو 4 وDPI لتصوير نوى الخلايا المنقولة.

يظهر هذا الشكل مثالاً لخلايا تعبر عن E four or four وGFP؛ حيث يوضح اللوح A تعبير بروتين GFP وحده كمجموعة ضابطة، ويوضح اللوح B تعبير E four or four. تظهر صبغة DAPI للنوى في اللوح C، وتظهر الصور المدمجة في اللوح D. تشير الأسهم البيضاء إلى الخلايا المنقولة بـ GFP وE.Four or four والتي تحتوي على نوى ذات شكل مورفولوجي استماتي. وتشير الأسهم الحمراء إلى النوى ذات الأشكال غير المنتظمة التي لا تُحتسب كنوى استماتية، بينما تشير النجمة إلى النوى الانقسامية أو النوى التي انقسمت للتو. تم عد عدد النوى المكثفة أو المجزأة التي تم تصورها بواسطة صبغة DAPI لحساب النسبة المئوية للنوى ذات المورفولوجيا الاستماتية ضمن مجموعة الخلايا المنقولة، وذلك للحفاظ على أقصى درجات الموضوعية في الاختبار.

تَمَّ إجراء عدُّ النوى المبرمج موتها (apoptotic nuclei) في العينات المختلفة بطريقة تعمية، حيث لم يكن الشخص القائم بالعد على دراية بهوية العينة. وتظهر النتيجة الممثلة في هذا الرسم البياني. لُوحظت نسب مئوية أعلى من التشوهات النووية في الخلايا التي تعبر عن E4orf4، مما يؤكد أن E4orf4 يحفز موت الخلايا. وقد لُوحظت أعلى نسبة من التشوهات النووية في الخلايا التي تعبر عن E4orf4 والتي انخفضت فيها مستويات ACF1 بواسطة تقليل التعبير الجيني بوساطة shRNA، مما يشير إلى أن تقليل تعبير ACF1 يعزز موت الخلايا الذي يحفزه E4orf4، ويزيد من سمية E4orf4 في الخلايا.

لم يؤدِ التعبير عن مستويات منخفضة من ACF 1 إلى زيادة في مستويات E4 أو 4 كما ظهر في تحليل Western blot. أثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تسهيل العد الدقيق للنوى الموتة المصبوغة بـ DPI وتطبيق معايير صارمة لتحديد هذه النوى. بالإضافة إلى هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل المقايسات المستنسخة (clon genic assays) للتحقق من نتائج DA pse التي تلي هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل مقايسات الترسيب المناعي المشترك للإجابة على أسئلة إضافية، على سبيل المثال، ما إذا كان هناك تفاعل فيزيائي بين البروتينات التي يتم استقصاؤها.