عبر الجسم الحي فرط الحساسية النوع المتأخر الفحص ل Antigen تنظيم محدد

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام مقايسة اختبار فرط الحساسية المتأخر عبر الجسم الحي (trans vivo DTH assay) لمراقبة الاستجابات المحددة للمستضدات، سواء كانت محفزة للالتهاب أو مضادة للالتهاب، لدى الأشخاص البشر. أولاً، قم بفصل الخلايا أحادية النواة من الدم المحيطي (PBMC) من الدم المحيطي للشخص الخاضع للدراسة. ثم اخلط تحضير PBMC مع محلول PBS.

استرجاع مستضد الاختبار ومستضد الاختبار بالإضافة إلى مستضد الاسترجاع. المباشرة بقياسات باطن قدم الفأر وحقن الخلائط المُحضرة في الفئران. تكرار قياسات باطن القدم بعد 24 ساعة. ثلاثة.

تكون الأنماط النهائية لاستجابات فرط الحساسية المتأخر (DTH) إما تنظيمية، أو غير تنظيمية، أو مُحسسة. ويمكن تطبيق مقايسة فرط الحساسية المتأخر عبر النقل الحي (trans vivo) لتحديد المعاملات السريرية مثل استجابات التفاعل الخيفي، حيث يكون مصدر المستضد هو خلايا المتبرع بالزراعة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الموجودة في المختبر (in vitro) في إمكانية الكشف بسهولة عن كل من الاستجابات المحفزة للالتهاب والاستجابات التنظيمية للمستضدات الخيفية، أو المستضدات الذاتية، أو المستضدات الورمية باستخدام نظام مقايسة واحد.

سيقوم إيغون، وهو باحث في مختبري، الآن بتوضيح الإجراء باستخدام دم محيطي بشري طازج تم جمعه في أنابيب سترات الديكستروز الحمضية لتجنب تنشيط الصفائح الدموية. قم بفصل خلايا PBMC باستخدام وسط فصل الخلايا اللمفاوية وفقاً للطرق القياسية. اغسل تحضير PBMC باستخدام PBS لإزالة الصفائح الدموية الملوثة.

إذا كان هناك تلوث ملحوظ بكرات الدم الحمراء، فقم بإجراء تحلل للخلايا الحمراء باستخدام محلول منظم لتحلل CK. ثم قم بإجراء غسلتين إضافيتين باستخدام PBS Resus. قم بتعليق PBMC في PBS بتركيز 10 مليون PBMC لكل ملليلتر من أجل allo antigen.

ابدأ باستخدام خلايا P BMCs، التي تم عزلها من الدم المحيطي للمتبرع باستخدام الإجراء الموضح سابقاً. ثم قم بإعادة تعليق خلايا المتبرع في PBS بتركيز 120 مليون خلية لكل ملليلتر وأضف 1 µM من PMSF لمنع تحلل البروتين.

قم الآن بمعالجة معلق الخلايا بالموجات فوق الصوتية باستخدام سبع نبضات مدة كل منها ثانية واحدة بواسطة جهاز سونيكاتور بمسبار قياسه 2 mm. وباستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer)، تحقق من تكسر أكثر من 90% من الخلايا.

بعد ذلك، قم بطرد الخليط مركزياً بسرعة 14, 000 RPM عند درجة حرارة أربع درجات Celsius لمدة 20 دقيقة. انقل السائل الطافي بعناية إلى أنبوب safe lock سعة 2 mL وحدد تركيز البروتين باستخدام الطرق القياسية لكل حقنة. قم بتقسيم 7 × 10⁶ من خلايا P BMCs في حجم 2 mL.

تُستخدم أنابيب Safe lock لترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي. أولاً، قم بتحضير معلق التحكم السلبي من PBMC في 35 microliters من PBS. ثم بالنسبة للتحكم الإيجابي، أضف 25 microliters من مستضد استذكاري، وهو tetanus toxoid و diptheria toxoid، واضبط حجم الحقن إلى 35 microliters باستخدام PBS.

وفقاً للتصميم التجريبي لتقييم الاستجابة المحددة للمانح، قم بإعادة تعليق كتلة الخلايا في 10 µL من مستضد المانح بالإضافة إلى 25 µL من PBS ليصل الحجم الإجمالي إلى 35 µL. ولتقييم التنظيم المحدد لمستضد المانح التجريبي، قم بإعادة تعليق كتلة الخلايا في 35 µL عن طريق إضافة 10 µL من مستضد المانح و 25 µL من مستضد recall TT DT. بعد تخدير فأر skid باستخدام isof fluorine، ضع فرجاراً محملاً بزنبرك في مركز وسادة القدم بحيث تلامس إحدى حواف الفرجار آخر وسادة مشي في القدم لتوفير نقطة مرجعية تضمن اتساق موقع القياس عند استقرار قراءة المقياس.

سجل سُمك وسادة القدم الأساسي قبل إجراء الحقن في وسادة القدم. ضع المحقنة بحيث تشير الإبرة نحو أصابع القدم ويكون الشطب متجهاً للأعلى. ابدأ الآن بعمليات الحقن تحت الجلد لكل معلق خلوي في وسائد القدم الخلفية للفأر.

أولاً، احقن وسادة القدم اليمنى ببطء بتركيبة الضابط السالب. بعد ذلك، احقن وسادة القدم اليسرى بالضابط الموجب المكون من PBMC بالإضافة إلى TT dt. الآن، أعد الفأر إلى قفصه.

ثانياً، يتم حقن وسادة القدم اليمنى بـ PBMC بالإضافة إلى allo antigen، وحقن وسادة القدم اليسرى بـ PBMC بالإضافة إلى allo antigen و TT dt. تأكد من عدم وجود أي تسرب بعد 18 إلى 24 ساعة من الحقن. يتم تخدير كل فأر باستخدام isof fluorine وتكرار قياس تورم وسادة القدم.

اطرح سُمك كل وسادة قدم قبل الحقن من القيمة بعد الحقن للحصول على قيمة تورم وسادة القدم. ثم احسب صافي التورم النوعي للمستضد عن طريق طرح قيمة تورم وسادة القدم الضابطة من قيم تورم وسادة القدم التي تم الحصول عليها من المعالجات. تحقق من قراءة الضابط الموجب للتأكد من وجود استجابة ضابطة موجبة للمستضد الاستذكاري TT DT بقيمة أكبر من أو تساوي 25 × 10⁻⁴ بوصة.

يُعد وجود استجابة خلفية لـ PBS شرطاً لاعتبار الاختبار صالحاً. بعد ذلك، يتم تحديد تثبيط استجابات الاسترجاع في وجود مستضدات المانح. يقيم هذا الاختبار متلقي زراعة الكلى من حيث الاستجابة النوعية لمستضدات المانح ومن حيث التنظيم.

هناك ثلاثة أنماط رئيسية من فرط الحساسية من النوع المتأخر لدى متلقي الأعضاء المزروعة: النمط التنظيمي، والنمط غير التنظيمي، والنمط التحسسي. وقد استجاب جميع المرضى بقوة للضابط الموجب المتمثل في مستضد الاستذكار tt. ويظهر المريض رقم 62 النمط التنظيمي الذي يتميز باستجابة ضعيفة لمستضد المانح وتثبيط مرتبط ملحوظ لاستجابة مستضد الاستذكار في وجود مستضد المانح.

هذا هو النمط الذي وُجد أنه مرتبط بالتحمل المناعي للطُعم العضوي. يُظهر المريض رقم 48 نمطاً غير تنظيمي، والذي يتميز باستجابة ضعيفة للمانح، ولكن دون وجود كبح مرتبط بها. وقد لوحظ هذا النمط بشكل متكرر لدى المرضى الذين يتناولون الأدوية المثبطة للمناعة.

يُظهر المريض رقم ثمانية نمط تحسس المانح الذي يتميز باستجابة عالية لمستضد المانح وعدم وجود تثبيط مرتبط. وترتبط هذه الاستجابة برفض الطعم. وفي دراسات الحالات السريرية، تم فحص خلايا BMCs من المرضى المشاركين في تجربة رصدية لتقييم الاستجابات عبر المسار غير المباشر الخاص بالمانح، واستجابات الخلايا T effector والخلايا T regulatory، وذلك لتقييم دور التنظيم الخاص بالمانح في التسامح السريري.

تكشف استجابات الخلايا التائية غير المباشرة لمستضدات المانح عن طيف متميز عبر مجموعات التسجيل. ويزداد تورم باطن القدم مع انتقال الحالة السريرية للمريض من أولئك الذين لديهم تحمل إلى أولئك الذين يعانون من رفض مزمن. وهنا، يقيس مقايسة التثبيط المرتبطة المسار غير المباشر لاستجابة الخلايا التائية التنظيمية المضادة للمانح.

تظهر هذه البيانات انخفاضاً في الاستجابات التنظيمية عبر النطاق الممتد من المرضى الأكثر تحملاً، مروراً بالمرضى متوسطي التحمل، وصولاً إلى المرضى الأقل تحملاً والذين يعانون من رفض مزمن. وبناءً على ذلك، يبدو أن التنظيم المناعي، كما تم قياسه بواسطة مقايسة DTH في الجسم الحي، يمثل آلية مهمة لقبول الطعم الكلوي.

يعد تطبيق مقايسة TDTH في مراقبة المناعة الذاتية مجالاً واعداً. وقد كشفت دراستنا لدور كولاجين النوع الخامس في العملية المرضية لمتلازمة التهاب القصيبات الانسدادي (BOS) أن أعلى خطر نسبي لتطور BOS لوحظ لدى المرضى الذين أظهروا استجابة إيجابية لكولاجين النوع الخامس في الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (pbmc) من متلقي زراعة الرئة، وليس لدى الضوابط الصحية أو كولاجين.

أظهر أربعة مرضى مصابين بمتلازمة المراعي الجيدة التفاعلية بعد عملية زراعة الكلى تفاعلية متكررة تجاه الكولاجين الخامس. كما يمكن استخدام مقايسة TDTH لاختبار تفاعلية الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (pbmc) من مرضى السرطان تجاه المستضدات النوعية للأورام. على سبيل المثال، قد يؤدي وجود الخلايا التائية التنظيمية النوعية لـ PAP لدى مرضى سرطان البروستاتا إلى الحد من الاستجابة للتطعيم بمستضد PAP.

يعد اختبار TRANSVAAL DTH اختباراً تشخيصياً مبتكراً له تطبيقات سريرية في تقييم الاستجابات المناعية الخلوية لدى مرضى زراعة الأعضاء والسرطان وأمراض المناعة الذاتية. وتكمن قيمته في أنه ليس مفيداً فقط في مراقبة استجابات استدعاء الخلايا التائية المؤثرة (t effector recall responses)، بل يمكن استخدامه أيضاً للكشف عن استجابات الخلايا التائية المنظمة (T regulatory responses) لأنه لا يعتمد على قياس سيتوكين معين للكشف عن الخلايا التائية المؤثرة أو المنظمة. ويتميز هذا الاختبار بمرونة عالية وقابلية واسعة للتطبيق.