تحليل وظائف الجينات والتخيل ولدت سيليا من تدفق السوائل في حويصلة كوبفر

الهدف من هذا الإجراء هو تعديل الجينات الوظيفية في حوصلة كافاس أو KV في جنين الزرد المسؤول عن الزخرفة اليسرى اليمنى وتحليل تدفق السائل غير المتماثل الناتج عن كليا motil عن طريق توصيل حبات الفلورسنت في kv. يتم تحقيق ذلك عن طريق حقن قليل النوكليوتيدات الفلورية التي تمنع التعبير عن جين معين ذي أهمية في خلية صفار البيض لجنين مرحلة ديلا في منتصف الصفيحة ، بحيث يتم تحميلها في الخلايا الظهرية الرائدة التي تؤدي إلى ظهور kv. بعد ذلك ، يتم اختيار الأجنة المحقونة التي تحتوي على مورفو فلوري فقط في خلية صفار البيض و kv لمزيد من التحليل.

ثم يتم تركيب الأجنة في شرائح الاكتئاب ويتم حقن حبات الفلورسنت في تجويف الحويصلة المملوءة بالسوائل في kv. أخيرا ، يتم استخدام الفحص المجهري بالفيديو لتسجيل الخرزات المتدفقة داخل kv. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تحدد ما إذا كان استنفاد الأنسجة الخاص بالجين المرشح في KV يغير تدفق السوائل غير المتماثل من خلال التحليل الكمي لحركات الخرز.

العرض الفيروسي لهذا الفصل الدراسي أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم حقن المولينو الخاصة بالمرحلة وحقن الخرز الفلوري لأن كلاهما يعتمد على اقتراح الجنين وتوقيت نمو التجربة. لإجراء حقن التحويل العالمي أو MO ، اجمع الأجنة مباشرة بعد الإخصاب وقم بتحميلها في لوحة الحقن. استخدم نارا مصقولة خلف الماصة لوضع الأجنة في صفيحة الحقن لشل حركة الأجنة.

اكسر طرف إبرة الحقن واضبط إعدادات الحقن لإنشاء قطرة حقن بحجم نانولتر واحد. باستخدام مجهر تشريح ، قم بحقن نانولتر واحد من MO في نير ما لا يقل عن 50 جنينا بين مرحلتي الخلية الواحدة والأربع مرحلتين. بالنسبة لحقن M mo المستهدف DFC ، اجمع الأجنة مباشرة بعد الإخصاب واحتضانها عند 28.5 درجة مئوية.

عندما تصل الأجنة إلى مرحلة 256 خلية ، قم بتحميلها بسرعة في لوحة الحقن وحقن نانولتر واحد من MO الفلوري في صفار البيض. حقن ما لا يقل عن 100 جنين بين 256 و 1000 مرحلة خلية لإجراء الحقن المستهدف بصفار البيض. بعد احتضان البويضات المخصبة إلى مرحلة القبة ، قم بحقن نانولتر واحد من MO الفلوري في نير ما لا يقل عن 100 جنين بين القبة و 30٪ هي مراحل رقائق.

عندما تصل الأجنة المحقونة إلى 75٪ من مرحلة الرقائق. قم بإزالة الأجنة غير المخصبة والميتة تحت مجهر تشريح لحقن MO العالمية. اختر الأجنة الحية للتألق موزعة بالتساوي في جميع الخلايا.

بالنسبة لحقن M mo المستهدفة DFC ، حدد الأجنة ذات التألق المنتشر في جميع أنحاء صفار البيض وتتركز في هامش الجلد الظهري. لحقن MO المستهدفة بصفار البيض. اختر الأجنة التي يتم فيها توزيع التألق بالتساوي في جميع أنحاء صفار البيض ولا يتم ملاحظتها في أي خلايا جنينية بين اثنين إلى أربعة.

لذا مراحل العث. حدد الأجنة المستهدفة DFC التي تظهر مضان فقط في خلايا KV وصفار البيض وتخلص من الباقي للحقن المستهدفة بصفار البيض. حدد الأجنة ذات التألق حصريا في صفار البيض لتحليل التدفق غير المتماثل في KV من MO تبدأ الأجنة المحقونة باستخدام ملقط حاد لطلاء حوالي 20 جنينا بعناية بين أربعة إلى ستة.

لذلك قد تنقل المراحل جنينا واحدا إلى شريحة الاكتئاب الزجاجي وتزيل أكبر قدر ممكن من الماء. قم بتثبيت الجنين عن طريق إضافة ما يكفي من الهواء الدافئ بنسبة 1٪ من نقطة الانصهار المنخفضة لتغطيته فقط عندما يتجمد الهواء. استخدم الملقط لوضعه بحيث يكون KV مواجها لأعلى 10 أجنة تعمل بسرعة لضمان اكتمال جميع الحقن بواسطة 10.

لذا مرحلة العث. بعد تخفيف حبات الفلورسنت الدقيقة بقطر 0.5 ميكرون إلى واحد إلى 50 في الماء المعقم. امزج الخرزات جيدا وقم بتحميل ثلاثة ميكرولترات في إبرة شعرية باستخدام نفس الحاقن الصغير المستخدم في حقن MO.

استخدم الملقط لكسر طرف الإبرة وضبط إعدادات الحقن لتوليد أصغر حقن ممكن. قطرة. بعد ذلك ، تحت مجهر تشريح ، قم بمحاذاة الإبرة مع تجويف KV للجنين المركب الأول. ثم أدخل الإبرة في التجويف وحقن أقل من 0.5 نانو لتر من الخرز.

أضف قطرة من الماء المعقم على الشقوق لتجنب جفاف الجنين تحت المجهر الفلوري المستقيم. باستخدام شاشة موضوعية 20 × ، يتم حقن الأجنة المحقونة للتسليم الناجح للخرز لكل جنين محدد مع حبات داخل KV عند قطرة من الماء المعقم لتغطية الحمال. ثم لاحظ استخدام مجهر مركب فلورسنت مع هدف غمس الماء 63 ×.

باستخدام كاميرا عالية السرعة مثبتة على المجهر ، قم بتسجيل فيلم من عشر ثوان. استخدم قناة الفلورسنت لتسجيل الخرزات بمعدل 70 إطارا في الثانية تقريبا وتباين المجال الساطع أو التداخل التفاضلي لتسجيل تجويف KV. قم باستيراد الأفلام إلى Image J.Create الحد الأقصى من الإسقاطات واستخدم البرنامج لتتبع حركات الخرزات الفردية.

يوضح هذا الشكل توزيع MO الفلوري في مرحلة ناجحة من الأجنة الحية المحقونة المحددة. يظهر هنا حقن MO غير ناجح يظل فيه المحلول مجمعا في خلية صفار البيض. يمكن قياس تدفق السوائل في الأجنة المحقونة بنجاح نوعيا أو كميا في جنين تحكم بحرز التدفق الطبيعي.

اتبع المسارات عكس اتجاه عقارب الساعة التي يمكن تصورها عن طريق إجراء أقصى إسقاط لمواضع حبة الفلورسنت بمرور الوقت أو عن طريق تتبع الخرزات الفردية بمرور الوقت. لإثبات فقدان التدفق المنسق ، تم حقن الأجنة ب MO لتحطيم صف كيناز اثنين B أو الصخور Two B ، مما يعطل التدفق ، ونتيجة لذلك ، تتحرك الخرزات بشكل عشوائي في kv ، يظهر متوسط سرعة خمس حبات من التحكم وصخور اثنين من أجنة B mo هنا بعد تطورها. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا التنموية لاستكشاف الجينات والآليات في إنشاء وصول الجسم الأيمن الأيسر في أسماك الزرد.