التحليل الكمي الالتهام الذاتي باستخدام المجهر مضان المتقدم 3D

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على صور كمية لخلايا ورم البروستاتا المعالجة لقياس درجة ومدى الالتهام الذاتي في نقاط زمنية مختلفة. يتم تحقيق ذلك عن طريق معالجة الخلايا أولا بالأرجينين أو الداز أو الكواشف التجريبية الأخرى للحث على الالتهام الذاتي و / أو موت الخلايا. الخطوة الثانية هي تحديد ما إذا كنت تريد تصوير الخلايا الحية أو الخلايا الثابتة وإعداد العينات وفقا لذلك.

بعد ذلك ، احصل على صور مضان ثلاثية الأبعاد للخلايا الحية أو الثابتة باستخدام الفحص المجهري الفلوري للإضاءة العريضة أو التلاف أو الإضاءة المنظمة. تتمثل الخطوة الأخيرة في جمع البيانات الإحصائية حول توزيع حجم البلعمة الذاتية وتحديد الموقع مع الهياكل الأخرى داخل الخلايا. باستخدام برنامج تحليل الصور الرقمية ثلاثية الأبعاد ، يمكن لهذا النهج الحصول على نتائج لا تظهر فقط أن تحريض العاثية الذاتية بواسطة الأرجينين يمكن أن يتسبب في موت الخلايا السرطانية في البروستاتا ، ولكن أيضا أن هذه الخلايا تظهر تغيرات هيكلية تختلف شكليا عن التغيرات المرتبطة بموت الخلايا المبرمج والنخر.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الأخرى الموجودة حاليا هي أن التصوير الكمي ثلاثي الأبعاد يمكن أن يظهر متى وأين يحدث حدث جزيئي معين داخل خلية حية ثم يقدمه في شكل ثلاثي الأبعاد لبدء نمو خلايا سرطان البروستاتا البشرية التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر ، يجب أن تكون سلسلة الضوء المقترنة ثلاثة على 35 ملم بولي دي ليسين المطلي بصحن ثقافة القاع الزجاجي كما هو موضح في خلايا بروتوكول النص بكثافة كافية لتسهيل الانتشار السريع ، ولكن ليس لدرجة أن الخلايا متضخمة وتتجمع بحلول وقت التصوير. عالج عينات الخلايا المختارة باستخدام الأرجينين داز أو DI في PBS لاستنفاد خلايا الأرجينين الحر والحث على الإجهاد الأيضي في الخلايا السرطانية قبل ساعة تقريبا من التصوير ، قم بتخفيف 1.5 ميكرولتر من Lyo Tracker باللون الأحمر مع 20 مل من RPMI تحتوي على 10٪ FPS و 1٪ مضادات حيوية. تحضير المحاليل باستخدام DI للعينات المختارة التي تمت معالجتها بعد تسخين جميع الوسائط إلى 37 درجة مئوية.

أضف الوسائط المناسبة إلى كل طبق ثقافة يحتضن الخلايا مع RPMI الذي يحتوي على LYO Tracker باللون الأحمر لمدة 15 إلى 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، أي قبل 30 دقيقة تقريبا من التصوير. قم بتشغيل العلبة البيئية لمحطة الطقس واسمح بالتوازن حتى 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون اغسل الخلايا باستخدام PBS واستبدل الوسائط ب RPMI القياسي الذي يحتوي فقط على 10٪ FBS و 1٪ مضادات حيوية. أضف DI إلى العينات كما هو موضح.

قم بتركيب أطباق ثقافة ذات قاع زجاجي مقاس 35 ملم في محول مخصص. استخدم زيت الغاطس على العدسة الموضوعية ذات الفتحة العددية الستة DX وفتحة العدسة 1.42 وضع طبق الاستزراع المركب على مرحلة المجهر. في هذا الفيديو ، يتم عرض الفحص المجهري ثلاثي الأبعاد باستخدام الوضع المطبق على IDV الشخصي من Delta vision ، ومجهر إزالة الالتفاف ومجموعة تطبيقات Associated Soft Works.

للبدء بتشغيل نظام المجهر ، بما في ذلك محطة عمل الاستحواذ ووحدة التحكم في الأدوات. افتح تطبيق التحكم في الكمبيوتر 3D لتهيئة مرحلة المجهر وتشغيل مصدر ضوء الزينون. اترك 10 دقائق حتى يسخن مصدر الضوء ويصل إلى ظروف مستقرة.

أضف قطرة من زيت الغمر على العدسة الموضوعية ذات الفتحة العددية DX الستة وفتحة العدسة 1.42 وتوسيط عينة الانزلاق مع انزلاق الغطاء لأسفل فوق العدسة الشيئية باستخدام إما إضاءة المجال الساطع أو الإضاءة الخارجية بالإضافة إلى التركيز البؤري الخشن. اضبط المقبض ارفع العدسة الموضوعية ببطء حتى يتلامس إيقاع زيت الغاطس مع زجاج الغطاء المقلوب. من هذه النقطة ، يجب أن يتم التركيز على طبقة الخلية في غضون بضع لفات من مقبض ضبط التركيز الدقيق.

عند العمل مع عينات ثابتة على الشرائح ، يوصى بتجنب الخلايا داخل أو بالقرب من أي مناطق بها فقاعات. عند العرض مع عينات حية على الطبق السفلي الزجاجي، تجنب تحريك العدسة الموضوعية خارج حدود زلة الغطاء الزجاجي. حدد مجال العرض المطلوب.

من الناحية المثالية ، يجب أن تظهر الخلايا إشارة فلورية جيدة في جميع القنوات المناسبة وأن تكون متصلة بشكل كاف وتنتشر على سطح زلة الغطاء بحيث يسهل تصور المحتويات داخل الخلايا. يمكن التحكم في التعديلات الصغيرة في التركيز الجانبي X و Y و Z بواسطة الكمبيوتر باستخدام واجهة الحصول على 3D. اضبط التثبيت على واحد تلو الآخر أو اثنين في اثنين اعتمادا على مجال الرؤية المطلوب لصورة معينة من خلال القسم الأوسط للخلية ، واضبط معلمات التعريض بحيث لا تتجاوز الحد الأقصى لكثافة البكسل 3000 عد.

بشكل عام ، يجب ضبط النسبة المئوية للانتقال عند أدنى مستوى ممكن دون زيادة التعرض المقابل. الوقت أكثر من ثانية واحدة. كرر هذا الإجراء لكل لون مضان يتم تصويره ولكل مجال رؤية منفصل.

للحصول على صور عالية الجودة ، قم بتعيين الحدود العليا والسفلية ل Zack عن طريق ضبط التركيز فوق الجزء العلوي والسفلي من عينة الخلية قليلا على التوالي. وبالتالي سيتم تحديد العدد الإجمالي للصور في مكدس Z معين من خلال هذه الحدود والتباعد بين الطبقات. لتقليل البيانات الاصطناعية للحركة أثناء الحصول على الصور، يمكن ضبط وضع الحصول على الصورة على الطول الموجي.

ثم مكدس ZS للعينات الثابتة ومكدس ZS ثم الطول الموجي للعينات الحية. بعد تعيين جميع المعلمات ، يمكن الحصول على الصور الفلورية. ثم يتم تفويض الصور الفلورية باستخدام الأعمال اللينة وتحليلها لاحقا باستخدام السرعة.

يوضح تسلسل الصورة الموضح هنا التغييرات الفيزيائية التي تحدث في خلايا cwr 22 خلال أول 80 دقيقة من تحريض الالتهام الذاتي. في هذه الصور ، يمثل الخط الأبيض المنقط الخطوط العريضة للخلية وتمثل المنطقة المظللة بالضوء موضع النواة. على مدار 80 دقيقة ، تكشف الصور عن إزاحة النواة بعيدا عن مركز الخلية ، وتقليل نقاط الالتصاق البؤرية والانتقال العام للجسيمات الجسمية والليزوزومات باتجاه مركز الخلية ، معروضة هنا باللونين الأخضر والأحمر على التوالي في نقاط زمنية لاحقة.

كما لوحظت زيادة طفيفة في التحديد المشترك بين الجسيمات الجسمية والليزوزومات كما يتضح من اللون الأصفر. ثم تم استخدام مجموعة تطبيقات التصوير الرقمي للسرعة لتحديد وحساب وجمع البيانات الإحصائية عن الجسيمات الجسمية والليزوسومات المصنفة في صور خلايا CWR 22. يظهر هنا عدد وحجم الجسيمات الذاتية بعد تكوينها الأولي عند الظهور يختلف بمرور الوقت.

بعد 80 دقيقة من تحريض الالتهام الذاتي ، كان هناك انخفاض تدريجي في صافي الأزرار في عدد الجسيمات الجسدية مع زيادة مقابلة في متوسط حجم الجسيمات الجسمية. بالإضافة إلى ذلك ، كانت هناك زيادة قابلة للقياس في تحديد موقع الجسيمات الذاتية والليزوزومات بناء على تحليل معامل الارتباط لبيرسون. تشير هذه النتائج معا إلى أنه عند تحفيز الالتهام الذاتي ، تشكلت العديد من الجسيمات الجسمية الصغيرة لتكوين جسيمات ذاتية أكبر بمرور الوقت.

تظهر هنا مقارنة جنبا إلى جنب للصور المكتسبة والمعاد بناؤها في وضع DV ، ومحاكاة تفكيك المجال العريض مقابل وضع الإضاءة المنظمة. تم تحسين الدقة الجانبية لاستخدام مجهر OMX إلى ما يصل إلى 120 نانومتر ضعف دقة الفحص المجهري المحدود التقليدي. كان التحديد المشترك على نطاق صغير للجسيمات الذاتية والجسيمات الحالة واضحا بوضوح مع الفحص المجهري فائق الدقة ، في حين أنها لم تكن واضحة مع التصوير الفلوري التقليدي.

تتمثل إحدى مزايا استخدام الفحص المجهري لإزالة الالتواء في إعادة بناء جميع الصور في نموذج ثلاثي الأبعاد يكشف عن معلومات مكانية أكثر دقة بين الجزيئات المختلفة. تظهر هنا صورة شاملة لخلية واحدة Cwr 22 RV تخضع للالتهام الذاتي في وقت لاحق حيث يبدأ حدوث قدر كبير من التوطين بين الجسيمات الجسدية والليزوزومات. يكشف التلوين المتماسك كما هو موضح باللون الأبيض عن الخطوط العريضة للخلية المستهدفة في هذا الفيلم.

يوفر النموذج ثلاثي الأبعاد المعاد بناؤه مزيدا من التفاصيل المكانية للاندماج بين الجسيمات الجسدية والجسيمات الحالة كما هو موضح باللون الأصفر ، فإن التفاعل بين سلسلة الضوء الأخضر ثلاث إشارات وإشارات الجسيمات الليزوزية الحمراء واضح في وجود الإشارات المدمجة لإنتاج اللون الأصفر. لذلك سيعالج هذا النهج تحديين رئيسيين للباحثين الذين يدرسون الالتهام الذاتي.

بادئ ذي بدء ، نريد الحفاظ على بيئة خالية من الإجهاد باستخدام السائل الدقيق ، غرفة الوفرة للحفاظ على حالتها الفسيولوجية الأصلية في مراحل المجهر. التحدي الثاني هو جمع بيانات الصور الكمية ذات الصلة إحصائيا ، وبالنسبة للخلايا الثابتة ، عادة ما نلتقط الكثير من الصور من خلايا مختلفة ونجمعها في معلومات مفيدة. ومع ذلك ، مع خلية الحياة ، نتبع خلية واحدة فقط بمرور الوقت للحصول على معلومات مكافئة.

لذلك نعتقد أن هذه التقنية ستمكن الباحثين الآخرين من دراسة وظيفة ودور الالتهام الذاتي في الأعضاء المختلفة والأمراض المختلفة.