توصيف نسيجية سليمة من الأجهزة بالغة الصغر زرع الدماغ والأنسجة المحيطة بها

الهدف من هذا الإجراء هو تصوير واجهة أنسجة المخ السليمة حول الأجهزة الدقيقة المزروعة بشكل مزمن في أنسجة دماغ القوارض. يتم تحقيق ذلك من خلال استخدام مطاط سيليكون سريع الخلية أولا وأكريليك أسنان مكون من جزأين لتغطية حج القحف وتشكيل غطاء جمجمة حول الجهاز المزروع في الدماغ. بعد حشو بمعالجة الأنسجة المثبتة وما بعد الوفاة ، يتم فصل الجزء المزروع في الدماغ من الجهاز عن غطاء الرأس عن طريق حرق أكريليك الأسنان وقطع الخلية السريعة.

بعد ذلك ، تتم إزالة الدماغ وتقطيعه باستخدام فيوم لالتقاط الغرسة في قسم الأنسجة. الخطوة الأخيرة هي تحضير الأنسجة للتصوير الفلوري عن طريق غسل الملصقات ، ثم تنظيف قسم الأنسجة في محلول المقاصة البصري. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري متحد البؤر لإظهار الاستجابة البيولوجية السليمة التي تنتجها غرسة الدماغ المخترقة في الأنسجة المحيطة على نطاق الخلية تحت الخلوية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التوضيح ، الجهاز ، هي أن التقنية تتجنب تعطيل الأنسجة المحيطة والملتصقة بالجهاز المزروع بحيث يمكن فحص الأنسجة المتداخلة سليمة. تعتمد هذه الطريقة على تقنيات الكيمياء المناعية والفحص المجهري المتقدمة وتؤدي إلى بيانات الفحص المجهري متحد البؤر التي تصف بالتفصيل المنطقة المحيطة بجهاز مزروع في الدماغ. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الأطراف الاصطناعية العصبية ، مثل الدرجة التي يؤثر بها موت الخلايا المحلية ، وتكوين الندبة الدبقية وإعادة تنظيم الأوعية الدموية ، على عمر أجهزة الأقطاب الكهربائية الدقيقة المزروعة في الدماغ.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للواجهة العصبية المزمنة لمصفوفات الأقطاب الكهربائية الدقيقة المزروعة في الدماغ. يمكن أيضا تطبيق التقنيات المتضمنة في هذه الطريقة على مجالات أخرى من أبحاث علم الأعصاب ، بما في ذلك القنيات المزروعة أو الألياف البصرية في غطاء الدخان ، ابدأ الإجراء عن طريق إزالة الجلد والأنسجة الأخرى حول غطاء الجمجمة الأكريليكي بعناية ، باستخدام ملقط ومقص صغير أثناء ارتداء القفازات غير الحساسة للحرارة. استخدم مكواة الجنيد لإنتاج نافذة في الانبعاج الأكريليك وفضح منطقة من الختم السريع الأساسي.

يجب أن يكون الجهاز مرئيا مغلفا بختم سريع واضح. بعد ذلك ، تحت المجهر الجراحي ، قم بتقطيع المطاط الصناعي من السيليكون باستخدام زوج من المقصات الدقيقة المنحنية. ثم قم بإزالة قطع صغيرة من الختم السريع باستخدام ملاقط ومقص صغير وصولا إلى الموضع الذي يدخل فيه الجهاز إلى الدماغ.

استمر في القطع على طول سطح حج القحف لفصل مكونات الجهاز المرتبطة بالبولي سيليكون والجمجمة عن المكونات المزروعة في الدماغ. كن حذرا عند القطع من خلال مكونات الجهاز المكشوفة. تجنب دفع أو سحب الغرسات في الأنسجة الثابتة.

ثم قم بإزالة العظم حول غطاء الرأس بعناية باستخدام shes الخام بعد ذلك. استخدم ملعقة لفصل الدماغ بالجهاز المزروع عن الجمجمة. الآن ضع الدماغ في طبق بتري زجاجي مليء ب HBHS.

استخدم كتلة الدماغ وشفرات الحلاقة لتقسيم الدماغ وإنشاء مستوى مسطح يتوافق بشكل وثيق مع زاوية الأجهزة المزروعة. بعد ذلك ، اضغط على شفرات حلاقة من خلال أنسجة المخ لتعريض السطح المسطح الذي سيتم تركيبه على Vibram. بعد ذلك ، ضع بعض الثلج تحت منصة Vibram.

ثم جفف سطح الأنسجة لفترة وجيزة على منشفة ورقية. بعد ذلك ، قم بتوجيه العينة بحيث يكون البعد الأوسع موازيا لاتجاه حركة شفرة النغمة الاهتزازية للمساعدة في تجنب احتمال ضرب الشفرة للأنسجة على الفور ، وقم بلصق المستوى المسطح على المسرح بالغراء الفائق. بعد أن يضع الغراء PBS مبردا على طبق الاهتزاز حول الأنسجة.

الآن قم بقص شرائح الأنسجة بين 250 إلى 500 ميكرون باستخدام الحد الأقصى لمعدل الاهتزاز ومعدل تقدم الشفرة البطيء بزاوية شفرة تبلغ 10 درجات من الأفقي. ثم اجمع الشرائح بعناية باستخدام فرشاة وملعقة مغرفة وقم بتخزين HBHS في طبق 24 بئر عند أربع درجات مئوية أثناء جمع الشرائح ، واحتفظ بسجل لسمك وموقع كل شريحة عند إزالتها إلى لوحة 24 بئر. بمجرد أن يصبح جهاز Insitu مرئيا ، اجمع شريحة من الأنسجة يبلغ سمكها حوالي 500 ميكرون.

من أجل التقاط الجهاز في شريحة أنسجة واحدة لجمع قسم أرق من الأنسجة ، يمكن جمع شرائح 100 ميكرون بعناية للاقتراب من الجهاز عن كثب. عند هذه النقطة يمكن جمع شريحة يقل سمكها عن 500 ميكرون مع الجهاز بداخلها. ابدأ معالجة الأنسجة بغسل الشرائح ثلاث مرات في خمس دقائق لكل غسلة في HBHS.

ثم احتضنها في هيدريد بورا الصوديوم لمدة 15 دقيقة. اقلب كل جانب من جوانب الشريحة الشريحة ببطء باستخدام فرشاة طلاء صغيرة وتجنب لمس أي مناطق حول الجهاز المزروع. يمكن أيضا استخدام ملعقة صغيرة من الفولاذ المقاوم للصدأ أو التفلون مع فرشاة الرسم الصغيرة.

الآن اغسل الشرائح ثلاث مرات في خمس دقائق لكل غسلة في محلول غسيل في درجة حرارة الغرفة. امنعها في محلول الغسيل لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أثناء تقليب الشرائح. بعد ساعة واحدة بعد ساعتين ، احتضن الشرائح في الجسم المضاد الأولي لمدة 48 ساعة تقريبا عند أربع درجات مئوية.

بعد ذلك ، قم بإجراء ست غسلات سريعة لمدة ثلاث دقائق بمحلول الغسيل. ثم قم بإجراء ست غسلات لمدة ساعة واحدة في محلول الغسيل. بعد ذلك ، احتضنها في جسم مضاد ثانوي لمدة 48 ساعة تقريبا عند أربع درجات مئوية.

مرة أخرى ، قم بإجراء ست غسلات سريعة لمدة ثلاث دقائق تليها ست غسلات لمدة ساعة واحدة في محلول الغسيل. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول الغسيل وأضف محلول التنظيف U2 القائم على الجلسرين. غطي الطبق بورق الألمنيوم واحفظيه على درجة حرارة أربع درجات مئوية.

اسمح للشرائح السميكة بتنظيف ما يقرب من أسبوع واحد أو أقسام الأنسجة السميكة جدا لمدة أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع من أربع درجات مئوية. بعد التخليص ، قم بتركيب أقسام المناديل على الشرائح باستخدام محلول المقاصة كوسائط تثبيت. أغلق جميع الشرائح بطلاء أظافر شفاف وقم بتخزينها على درجة حرارة أربع درجات مئوية بعيدا عن الضوء ، باستخدام أهداف مجهر لمسافة عمل أطول.

ابدأ التصوير باستخدام مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر أو مجهر فوتونين. سنوضح باستخدام برنامج إرسال XS L SM seven 10 Carl Xi ومرحلة ترجمة XY التي يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر إلى صورة بانوراما ثلاثية الأبعاد حول غرسة لتصحيح معامل الانكسار لمحلول المقاصة. في هذا العرض التوضيحي ، ندخل قيمة معامل الانكسار 1.4 في برنامج مجهر Leica Zen لحل المقاصة U2.

هذا الإعداد بضبط الفواصل الزمنية لخطوات Z بمهارة لحساب عدم تطابق معامل الانكسار في الأنسجة القريبة من الجهاز. قم بتقييم نافذة المحور Z المناسبة وإعدادات جمع البيانات تقريبا في بعد zdi لكل قناة فلورية باستخدام طاقة ليزر منخفضة ، حوالي 0.5 إلى 5٪ وأحجام خطوات Z كبيرة. ثم استخدم برنامج Zen panorama لتعيين الهدف في مركز XY للبانوراما النهائية ولتحديد عدد مواضع التجميع المطلوبة للمحور x و y.

لتغطية منطقة اهتمامك، أعد تقييم نافذة مجموعة المحور Z وقم بإنهائها عن طريق التحقق بسرعة من الإطارين الأول والأخير للمكدس. بعد ذلك ، اضبط حساسية الكاشف وطاقة الليزر يدويا على المنحدر بشكل مناسب مع زيادة العمق. الهدف عادة هو الحفاظ على نفس كثافة الصورة تقريبا بغض النظر عن عمق التصوير في شريحة الأنسجة ، وكذلك لتجنب ضوضاء الخلفية العالية.

اجمع كل سلسلة بيانات صور فلورية إذا لزم الأمر لتجنب تداخل الإشارات ، وقم بتشغيل خطوط الليزر بالتتابع. قم بتغيير إعدادات البرنامج لجمع البيانات أو بيانات النفاذية واستخدم ليزر أطول بطول موجي أكثر اختراقا ، مثل 6 33 نانومتر لالتقاط هذه القنوات. ثم حدد طاقة الليزر المناسبة واكتشف حساسية للانعكاس وجمع النفاذية وكرر نفس سلسلة التجميع حول الجهاز المزروع.

أخيرا ، قم بتصدير البيانات لقياس الكمية والتحليل في وقت لاحق. يمكن أن يسمح لك التصوير من خلال جانبي الشريحة بتقييم الواجهة حول الجهاز كما هو موضح هنا حيث تكون الخلايا الدبقية الصغيرة على طول دعامة السيليكون ل MEA مرئية من جانب واحد والخلايا الدبقية الصغيرة على طول مواقع الأقطاب الكهربائية والآثار مرئية على الجانب الآخر. بمجرد أن يمكن تصوير الأنسجة المركبة باستخدام مرحلة ترجمة XY ، يمكن إنشاء لمحات عامة عن ملصقات الفلورسنت عبر شريحة الأنسجة بأكملها بالدقة المطلوبة.

هنا ، نوى الخلية ملطخة بخطافات 3 ، 3 ، 3 ، 4 2 والخلايا الدبقية الوحيدة المسمى 3 2 9. تم تصوير Anti IBA في وقت واحد على قنوات منفصلة. كما تم جمع ضوء الإرسال والانعكاس الذي يوضح موقع الزرع لمدة أربعة أسابيع فيما يتعلق بالخطافات وبيانات IVA one ، وتراكب جميع القنوات ، ولكن يتم عرض الإرسال هنا.

يمكن جمع الفحص التفصيلي لواجهة الأنسجة المحفوظة شكليا حول الأجهزة الدقيقة المزروعة تحت تكبير عال لتحليل استجابة الأنسجة المحلية ، ويسمح الانعكاس والنفاذية بتوطين الجهاز بينما تسمح الأجسام المضادة الفلورية أو الملصقات الكيميائية بالتصوير التفصيلي لمكونات الأنسجة على طول واجهة الأنسجة السليمة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تأخذ وقتا في الفصل الدقيق للأجهزة المزروعة من خلال غطاء الرأس والتخطيط لهذه الخطوة لتستغرق ما يزيد عن 30 دقيقة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية جمع ومعالجة شرائح الدماغ التي تحتوي على أجهزة مزروعة.

يجب أن تكون قادرا أيضا على تسمية وجمع البيانات النسيجية التي تصف البيولوجيا العصبية المحيطة بهذه الأجهزة.