تحليل Coculture من تفاعلات البروتين خارج الخلية التي تمس افراز الانسولين من قبل خلايا بيتا في البنكرياس

الهدف العام من هذا الإجراء هو التحقيق في كيفية تأثير التفاعلات عبر الخلايا التي تتضمن المجالات خارج الخلية لبروتينات غشاء معينة على وظيفة خلايا بيتا وبشكل أكثر تحديدا على إفراز الأنسولين. يتم تحقيق ذلك عن طريق التحويل الأول ، وهو خط خلية ثدييات مع بلازميد يحتوي على البروتين محل الاهتمام في الخطوة الثانية. خط خلايا بيتا هو زراعة مشتركة مع خلايا الثدييات.

في الخطوة الأخيرة ، يتم تحضين الزراعة المشتركة في وسط بتركيزات مختلفة من الجلوكوز من أجل تمكين تقييم إفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز. في النهاية ، يتم استخدام المقايسات المناعية الراديوية للأنسولين أو Eliza لتقييم مستويات الأنسولين التي تفرزها خلايا بيتا المستنبتة في الوسط. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل الإفراط في التعبير عن الجينات والضربة القاضية ، هي أنها تتجنب اضطراب mRNA وتعبير البروتين الذي يحتمل أن يؤثر على صحة خلايا بيتا و / أو وظيفته بطرق يمكن أن تربك تحليلات التفاعل المحدد للبروتين.

ابدأ بنقل خلايا HEC 2 93 إلى صفيحة 24 بئر في 0.5 مل من وسائط HEC 2 93 لكل بئر لضمان انتشار الخلايا بالتساوي عبر قاع اللوحة. هز اللوحة على طول محور واحد في كل مرة بسرعة متزامنة مع الموجة المتكونة في البئر. عندما تصل خلايا HEC 2 93 إلى 100٪ من الطلاقة المشتركة ، قم بنقل الثقافات ب 0.8 ميكروغرام من ترميز البلازميد للبروتين محل الاهتمام في ميكرولترين من ليبو 2000.

وفقا لبروتوكول lipo ، يتم تصوير المخطط العام للزراعة المشتركة التي على وشك إظهارها هنا باستخدام مزيل الخلايا غير الأنزيمي. ابدأ هذه الخطوة بحصاد خلية INS واحدة بطلاقة 70 إلى 80٪ تقريبا من قاع قارورة ثقافة T 75. بعد تدوير الخلايا لمدة ثلاث دقائق عند 150 جيجابايت في درجة حرارة الغرفة ، استخدم ماصة P 1000 لإعادة تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من نصف INS واحد ونصف.

ثم يستخدم الوسائط ماصة سعة 10 مليلتر لإضافة 24 مل إضافية من الوسائط المختلطة وتعليق الخلايا ، وتستنشق الوسائط من آبار صفيحة 24 بئر تحتوي على خلايا HEC 2 9 3. ثم باستخدام ماصة P 1000 ، أضف برفق 500 ميكرولتر من معلق الخلية الواحدة INS على طبقة الخلية السداسية على طول جوانب البئر. بعد كل ستة آبار ، استخدم ماصة سعة 10 ملليلتر لإعادة تعليق الخلايا الواحدة INS.

مرة أخرى لضمان تعليق الخلايا المتجانسة. الآن احتضان الخلايا لمدة 24 إلى 48 ساعة ، اعتمادا على البروتوكول التجريبي. بعد احتضان الخلايا للفترة التجريبية المرغوبة ، واحدة بئر في كل مرة ، استنشق وسط الزراعة المشتركة بيد واحدة واستبدل الوسائط على الفور ب 250 ميكرولتر من 2.5 مللي مولار جلوكوز في عازلة بيكربونات كريبس رنجر باليد الأخرى.

بعد الحضانة المسبقة للمزارع المشتركة لمدة ساعة واحدة ، استبدل المخزن المؤقت KRB منخفض الجلوكوز ب 250 ميكرولتر من 2.5 ملليمولار أو 20 مليمولر جلوكوز. بعد ساعة أخرى من الحضانة ، انقل المخزن المؤقت KRB إلى أنابيب الطرد الدقيقة وقم بتدوير المخزن المؤقت لمدة خمس دقائق عند 1500 جيجابايت وأربع درجات مئوية أثناء وجود الأنابيب في جهاز الطرد المركزي. أضف على الفور 100 ميكرولتر من محلول تحلل خلايا rippa مع مثبطات البروتياز إلى اللوحة واحتضن اللوحة لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

عندما تنتهي الأنابيب من الدوران ، قم بإزالة 200 ميكرولتر من المادة الطافية لتحليلها لاحقا بواسطة المقايسة المناعية الإشعاعية للأنسولين أو إليزا. أخيرا ، قم بتدوير ما يعرف الآن بمحللة الخلية لمدة 15 دقيقة عند 10 ، 000 جرام ثم قم بإزالة 50 ميكرولترا من SNAT لتحليلها بواسطة المقايسة المناعية الراديوية للأنسولين أو إليزا. هنا ، تظهر النتائج التي تم الحصول عليها من الخلايا المشتركة INS واحدة من خلايا بيتا مع HC 2 93 خلية تم نقلها للتعبير عن شكل إسوي ليجن عصبي يشار إليه هنا باسم NLX.

زاد التعبير عن NLX من إفراز الأنسولين القاعدي والمحفز بواسطة الخلايا المزروعة I NS الواحدة. يجب أن يتفاعل مجال NX خارج الخلية مع بروتين أو جزيء آخر على سطح الخلية الواحدة I NS لجعل خلايا INS لإفراز المزيد من الأنسولين. يتم تصوير نتائج الأنواع الأخرى من التحليلات باستخدام نظام الزراعة المشتركة في هذين البيانين التاليين.

في هذا الرسم البياني الأول ، تظهر الزيادة في محتوى الأنسولين في الخلايا المزروعة المشتركة INS بواسطة NLY. بينما في هذه التجربة ، تم حصاد الحمض النووي الريبي من طبقة الخلية وتحليله بواسطة R-T-Q-P-C-R. زادت الزراعة المشتركة مع NLY من مستويات الأنسولين و PDX واحد mRNA.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق إضافية مثل QPCR أو الكيمياء المناعية الكمية للإجابة على أسئلة إضافية مثل ما إذا كانت التفاعلات خارج الخلية للبروتين المنقول يمكن أن تسبب تغييرات في بنية الخلية أو التعبير الجيني.