A تعدد في منصة الفرز القائم على luciferase المراسل لاستجواب المرتبطة بالسرطان نقل الإشارة في الخلايا المستزرعة

الهدف العام للبروتوكول التالي هو تمكين استجواب مقياس الجينوم لوظيفة الجينات من خلال مراقبة القراءات الخلوية المتعددة في وقت واحد. في هذا العرض التوضيحي ، يتم استخدام المراسلين القائمين على Firefly RAN و Cipro Dina Luciferase لمراقبة نشاط مسار P 53 WINT و KRAS على التوالي. هؤلاء المراسلون الثلاثة متنقلون مع إيرنا يستهدف جينا مهما في كليات التقنية العليا واحدة 16 خلية, خط خلايا سرطان القولون والمستقيم.

بعد ذلك ، يتم قياس أنشطة اليراع والفانيليا لوسيفيراز في محللات الخلية أثناء نشاط Cipro DEA luciferase. يتم قياس الإنزيم المفرز في الثقافة. تم الحصول على نتائج متوسطة تظهر قابلية استنساخ نظام الفحص بالإضافة إلى القدرة على الكشف عن الإجراءات المشتركة والفريدة للجينات ضمن هذه المسارات الثلاثة ذات الصلة بالسرطان.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الأشعة الدقيقة أو الأشعة متعددة الألوان ، هي أنها طريقة ميسورة التكلفة وعالمية وفعالة من حيث التكلفة للنظر إلى المخرجات الخلوية للنسخ. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة في أبحاث السرطان مثل تطوير استراتيجيات علاجية مستهدفة جزيئيا. على الرغم من أن جهد بروتوكول الشفافية العابر IL والحد الأدنى من الالتزام بالوقت المسبق لإعداد الشاشة ، فمن المحتمل أن يزداد بشكل جيد إلى تباين إشارة الجيد ، والذي يمكن مواجهته من خلال النظر إلى نسب التقرير بدلا من النظر إلى الإخفاقات المطلقة من الآبار لبدء هذا الإجراء ، اغسل خمس لوحات مربعة بحجم 10 سم من 80 إلى 90٪ HCT ملتقى 16 خلية واحدة مع PBS ثم حصاد الخلايا عن طريق التربسين لكل لوحة.

استخدم ملليلتر واحد من محلول التربسين متبوعا بالتحييد مع 10 ملليلتر من DMEM يحتوي على 2٪ FBS و 1٪ بنسلين. ينقل الستربتومايسين الخلايا العالقة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر وجهاز طرد مركزي عند حوالي 130 جم لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 10 ملليلتر من الوسائط.

احسب رقم الخلية بعداد خلية ثم اصنع محلولا خليا يحتوي على 10 إلى خمس خلايا لكل مليلتر. احتفظ ب 150 مل من تعليق الخلية للخطوة التالية باستخدام لوحة موزع السوائل الآلي متعدد القطرات. 100 ميكرولتر أو 10 إلى الخلايا الرابعة في كل بئر من لوحة ثقافة 96 بئر.

يجب أن يكون تعليق الخلية في هذه الحالة كافيا للطلاء 1296. تحتضن ألواح الآبار الصفائح بخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة بها 5٪ ثاني أكسيد الكربون أثناء تحضير خليط التعداد. تم عزل الحمض النووي لبناء المراسل عالي الجودة المستخدم هنا باستخدام مجموعات إعداد MIDI القياسية وتخفيفه إلى تركيز نهائي قدره ملليغرام واحد لكل مليلتر.

لكل مراسل ، قم بإعداد 100 ميكرولتر من محلول مخزون بناء المراسل عن طريق الجمع بين 30 ميكرولتر التالية من P 53 ، FL 30 ميكرولتر من ثمانية X-T-C-F-R-L 30 ميكرولتر من الأيائل واحد G أربعة ستة ميكرولتر من U-A-S-C-L وأربعة ميكرولتر من H اثنين OH. سينتج عن ذلك خليط من الحمض النووي بنسبة نهائية من واحد إلى واحد إلى واحد إلى 0.2 من المراسلين وتركيز نهائي للحمض النووي يبلغ 0.3 ملليغرام لكل ملليلتر. بعد ذلك ، قم بإعداد مخاليط تعداء I-R-N-A-D-N-A كافية لنقل 1296.

تخفف ألواح الآبار 80 ميكرولترا من محلول المخزون الذي يبني المراسل في ثمانية ملليلتر من المخزن المؤقت EC من مجموعة تأثير QIAGEN للحصول على محلول الحمض النووي بتركيز نهائي يبلغ ثلاثة ميكروغرام لكل لوحة مليلتر. 20 ميكرولترا من محلول الحمض النووي في كل بئر من لوحة PCR سعة 96 بئر. سيعتمد عدد ألواح الآبار البالغ عددها 96 على عدد أحواض الآبار التي سيتم اختبارها.

على سبيل المثال ، في هذه الحالة ، سنحتاج إلى 4 96 لوحة بئر للتقييم. يقوم 384 تجمع مختلف سيدي أ باستخدام معالج السوائل الآلي بيوم بنقل ميكرولترين من كل خمسة ميكرومولار siRNA إلى البئر المقابل للوحة تفاعل البوليميراز المتسلسل التي تحتوي على مخزون الحمض النووي المخفف. بعد ذلك ، أضف ميكرولتر واحد من محلول المحسن إلى كل بئر من لوحة الحمض النووي siRNA.

اسمح للتفاعل المحسن بالحدوث في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم أضف ثلاثة ميكرولترات من كاشف التعداء المؤثر إلى كل بئر واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق إضافية. لوقف تكوين مركب التعدي ، أضف 10 ميكرولترات من DMEM تحتوي على 2٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين إلى كل بئر من لوحة PCR.

استرجع 1296 لوحة بئر تحتوي على كليات العليارا 16 خلية واحدة من الحاضنة. انقل 10 ميكرولترات من خليط التعداء إلى كل بئر من صفيحة 96 بئر تحتوي على الخلايا حيث سيتم إجراء كل تعداء في ثلاث نسخ. سيتم تطبيق نفس الخليط على لوحين إضافيين من 96 بئر تحتوي على خلايا.

احتضان الخلايا بمخاليط التعداء عند 37 درجة مئوية في بيئة رطبة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 36 ساعة. 36 ساعة بعد تعداء الخلايا. أنشطة لوسيفيراز جاهزة للقياس.

نظرا لأن هذه الدراسة تضم العديد من المراسلين ، أحدهم يفرز في وسط الثقافة واثنان آخران يتم التعبير عنهما في سيتوبلازم الخلية. سيتم الحصول على القياسات من كل من وسط الاستزراع وكذلك التحلل الخلوي للكشف عن نشاط Cipro Dina luciferase أو CL في المزرعة. لوحة طبق الأصل متوسطة.

20 ميكرولتر من وسط الثقافة إلى صفيحة بئر بيضاء غير شفافة 96. باستخدام القطرة المتعددة ، أضف 20 ميكرولترا من المخزن المؤقت لمقايسة CL إلى كل بئر. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولترات من Cipro Dina Lucifer والركيزة إلى كل بئر واكتشف نشاط CL باستخدام مقياس الإضاءة للكشف عن أنشطة لوسيفيراز اليراع والفانيليا لوسيفيراز ، يجب أولا إجراء محللات الخلايا.

قم بإزالة وسط الثقافة من الخلايا عن طريق قلب كل لوحة رأسا على عقب ورمي الوسط في الحوض. قم بإزالة الوسط المتبقي عن طريق النقر برفق على اللوحة المقلوبة على المناشف الورقية. أضف 30 ميكرولترا من مخزن مؤقت للتحلل السلبي إلى كل بئر من الخلايا.

ضع الألواح على منصة هزاز مضبوطة بسرعة متوسطة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد خمس دقائق ، أضف 20 ميكرولترا من كاشف فحص لوسيفيراز إلى كل بئر من الخلايا وقم بقياس نشاط لوسيفيراز اليراع على الفور باستخدام مقياس الإضاءة. بعد ذلك ، أضف كاشف التوقف والتوهج لإخماد نشاط لوسيفيراز اليراع ثم قياس نشاط لوسيفيراز.

قبل تعدد الإرسال ، تم تقييم متانة منصات الفحص الثلاث المختلفة بشكل فردي. تم نقل خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم المشار إليها باستخدام ثمانية XTCF PP 53 ta Luke أو ALK واحد من تركيبات مراسل ترميز Firefly Luciferase جنبا إلى جنب مع مجموعات siRNAs التي تستهدف WINT beta-Catenin P 53 أو KAS على التوالي. يشار إلى الأنماط الجينية ذات الصلة بالمسار لكل خط خلية.

تم تقييم قوة كل منصة غربلة من خلال قابلية تكرار هذه التأثيرات المستحثة على مسار نقل الإشارة ذي الصلة. كما هو موضح في هذه النتائج التمثيلية ، فإن البيتين و siRNAs ليس لهما أي تأثير على نشاط مراسل XTCF الثمانية في خلايا RKO. على النقيض من DLD واحد و HCT واحد 16 خلية, أي على التوالي نقص في المسار [ا], بروتين مثبطة ويعبر عن شكل ينشط من [بيكا تينين].

بعد ذلك ، تبين أنه يمكن استخدام هؤلاء المراسلين معا لإجراء قياسات متزامنة لنشاط الجينات لمسارات نقل إشارة الرياح بيتا كاتينين P 53 و KRAS باستخدام تجمعات IRNA المشار إليها في هذه الرسوم البيانية. يتم عرض أنشطة اللوسيفيراز النسبية على المحور Y وتظهر siRNAs التي تستهدف الجين المشار إليه محل الاهتمام على المحور X. على سبيل المثال ، يقلل تجمع siRNA الذي يستهدف بيتا كاتينين من نشاط مسار الرياح بيتا كاتينين ، بينما لا يؤثر بشكل كبير على مسارات P 53 و KRA S.

أثناء محاولة تطوير نظام مراسل متعدد الإرسال ، من المهم تحسين خط الاهتمام الخلوي لمنطقة التعدي ونية إشارة المراسل.